eEF2K沉默聯合丹參酮ⅡA磺酸鈉協同抑制人肺腺癌細胞系A549增殖

王 布，袁勝芳，張長洪，苑 程，黃攀登，張志華，趙建清

(河北北方學院附屬第一醫院 呼吸內科， 河北 張家口 075000)

肺癌是癌相關死亡的第一大因素，主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩大類型；其中，肺腺癌(lung adenocarcinoma)是非小細胞肺癌最常見的亞型，有著較低的總體生存率[1]。目前，靶向治療是肺癌治療的一種重要手段，有著高效和不良反應少等優點；然而，肺癌的發生發展是一個復雜的過程，不僅僅依賴于一種基因或通路的調控，單一的靶點模式不足以遏制腫瘤生長，因此多靶點聯合治療已成為肺癌研究的熱點。真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor-2 kinase，eEF2K)是α-激酶小家族中唯一的Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶，可通過磷酸化其底物eEF-2抑制肽鏈延伸過程，并可通過影響細胞增殖、凋亡和侵襲等過程參與腫瘤的發生發展[2]。已有研究指出，eEF2K在肺癌中高表達，而靶向抑制其表達可阻斷肺腺癌細胞系A549轉移[3]，但其是否參與肺癌細胞凋亡的調控并不清楚。丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS)是中藥丹參有效成分丹參酮ⅡA的一種水溶性成分。丹參酮ⅡA可通過抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡發揮抑制A549細胞增殖的作用[4]，同時STS被證實可通過聯合順鉑起到協同抑制肺癌侵襲轉移的作用[5]。然而，靶向抑制eEF2K與STS聯合作用于肺癌能否起到協同抗腫瘤的作用并不清楚。因此，本研究以A549細胞為研究對象，通過觀察靶向抑制eEF2K與STS二者聯合對A549細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響并探討其可能的作用機制，以期為肺癌的臨床多靶點治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細胞系A549(上海紀寧實業有限公司)；丹參酮ⅡA 磺酸鈉(STS)(上海第一生化藥業有限公司)；DMEM培養基、脂質體3000、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒和Transwell小室(北京索萊寶科技有限公司)，靶向eEF2K基因的siRNA(siRNA-eEF2K)及其陰性對照(siRNA-NC)、實時熒光定量PCR試劑盒(百奧邁克生物公司)；胎牛血清、Trizol試劑、細胞計數試劑盒-8(cell counting Kit-8，CCK-8)(上海生工生物工程有限公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、Ki67、基質金屬蛋白酶2(matrix metallo-proteinase 2，MMP-2)、eEF2K、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、磷酸化(phospho，p)-AKT和B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理：篩選STS作用濃度：1)分為5個STS處理組(1.25、2.5、5、10和20 μg/mL STS)和無藥組(0 μg/mL STS)，每個處理設3個復孔，CCK-8法檢測細胞存活率，確定后續實驗STS作用濃度。在80%相對濕度、5% CO2、37 ℃恒溫細胞培養箱內使用含100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清的DMEM培養基培養A549細胞。2)將指數期的A549細胞接種至6孔板上后，培養箱內培養至70%匯合度時，嚴格按照脂質體3000說明書步驟將siRNA-eEF2K及siRNA-NC轉染至A549細胞中，分別作為siRNA-NC組(轉染siRNA-NC 48 h后繼續培養48 h)、siRNA-eEF2K組(轉染siRNA-eEF2K 48 h后繼續培養48 h)、siRNA-NC+STS組(轉染siRNA-NC 48 h后給予10 μg/mL STS作用48 h)、siRNA-eEF2K+STS組(轉染siRNA-eEF2K 48 h后給予10 μg/mL STS作用48 h)，每組設3個復孔。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測A549細胞eEF2K mRNA表達：向A549細胞中加入1 mL Trizol試劑提取總RNA后，反轉錄合成cDNA；將cDNA作為模板，根據合成的eEF2K引物(上游引物：5′-GAAC ATGAGCGACGTGACCTTC-3′；下游引物：5′-GGATG CCATGTTATCGAGGTCAC-3′)及內參GAPDH引物(上游引物：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′；下游引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′)在20 μL反應體系(cDNA 2 μL、濃度20 μmol/L的正反引物各0.2 μL、SYBR Premix Ex Tag 10 μL和H2O 7.6 μL)下于熒光定量PCR儀上進行擴增。其中，擴增條件為95 ℃ 4 min后進行35個循環階段：95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s。將GADPH作為內參基因，以2-△△Ct法計算A549細胞中eEF2KmRNA表達水平。該過程重復3次。

1.2.3 CCK-8法檢測A549細胞存活率：向處理后的細胞中加入10 μL CCK-8試劑；孵育30 min后，采用酶標儀于490 nm波長處檢測A549細胞吸光度值(A)值，并根據公式存活率(%)=(藥物組A-空白組A)/(對照組A-空白組A)×100%計算各處理組細胞的存活率。空白組為不含細胞的培養基。該過程重復3次。

1.2.4 克隆形成實驗檢測A549細胞克隆形成率：胰蛋白酶消化收集指數期的siRNA-NC組、siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細胞，調整細胞濃度后將其按照每孔500個種植到6孔板上。在細胞培養箱內常規培養10～14 d，待有肉眼可見克隆形成時，結束培養；棄培養液后，使用4%多聚甲醛固定細胞15 min，滴加Giemsa染色液染色10 min；洗去染色液后，肉眼觀察各組克隆細胞數，并以克隆細胞數與接種細胞數的百分比表示各組細胞的克隆形成率。該過程重復3次。

1.2.5 Transwell小室法檢測A549細胞穿膜數：按照1∶3比例以無血清培養基對Matrigel膠稀釋后，取40 μL平鋪至Transwell小室底部膜的上層，并在培養箱內孵育2 h。收集處理結束后的siRNA-NC組、siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細胞，以無血清培養基調整細胞為1×106個/mL。在Transwell小室上室內每孔加入細胞懸液200 μL，小室下室內每孔加入含10%胎牛血清DMEM培養基600 μL；置于培養箱內培養過夜后，取出Transwell小室；棉簽擦去上室殘留細胞后，分別以4%多聚甲醛和0.5%結晶紫染色對細胞進行固定15 min、染色10 min。洗去染色液后，采用倒置顯微鏡于200倍下觀察統計穿膜細胞數。該過程重復3次。

1.2.6 劃痕實驗檢測A549細胞遷移率：在6孔板背面以Marker筆過孔畫橫線，其中每孔有5條橫線穿過。將指數期的A549細胞接種至6孔板上后，根據1.2.1中實驗2)對細胞進行分組處理；待處理結束后，以移液槍槍頭垂直于橫線劃痕。以磷酸緩沖液洗去劃下的細胞后，置于細胞培養箱內繼續培養。分別在培養0 h和24 h時間點拍照并計算各組細胞遷移率。其中，遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。該過程重復3次。

1.2.7 流式細胞儀檢測A549細胞凋亡率：胰蛋白酶消化收集處理結束后的siRNA-NC組、siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細胞后，以預冷的磷酸緩沖液洗滌細胞2次。1 000 r/min離心5 min，加入1×結合緩沖液200 μL懸浮細胞后，先后加入annexin V-FITC和PI工作液各5 μL，混勻后避光下室溫孵育15 min后，補加1×結合緩沖液300 μL后，1 h內用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。該過程重復3次。

1.2.8 免疫印跡法檢測A549細胞eEF2K、AKT、p-AKT、ki67、Bcl-2和MMP-2蛋白表達水平：胰蛋白酶消化收集待測的A549細胞后，加入細胞裂解液抽提細胞總蛋白。對蛋白樣品定量后，與等體積上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中煮沸變性5 min。行SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白樣品轉至偏氟乙烯膜上。置于含脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h后，在4 ℃下以特異性一抗eEF2K(1∶1 000)、AKT(1∶2 000)、p-AKT(1∶2 000)、Ki67(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)孵育過夜；次日，再以二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h后，加ECL發光劑于暗室內顯影曝光。以GAPDH為內參，凝膠成像分析系統分析eEF2K、AKT、p-AKT、ki67、Bcl-2和MMP-2蛋白表達水平。該過程重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 STS對肺腺癌A549細胞作用濃度的篩選

相較于無藥組，1.25、2.5、5、10、20 μg/mL STS處理組作用48 h后A549細胞存活率均明顯降低(P<0.05)(表1)且呈一定的濃度依賴性。采用GraphPad Prism軟件計算出STS對A549細胞的半數抑制濃度為10.39 μg/mL。故后期選取10 μg/mL STS進行實驗。

表1 不同濃度STS作用48 h后A549細胞的存活率

2.2 轉染后肺腺癌A549細胞中eEF2K表達

與siRNA-NC組比較， siRNA-eEF2K組細胞中eEF2K蛋白和mRNA表達水平均明顯降低(P<0.05)(圖1，2)。

圖1 A549細胞中eEF2K蛋白表達Fig 1 Expression of eEF2K protein in A549 cells

*P<0.05 compared with siRNA-NC group圖2 A549細胞中eEF2K蛋白和mRNA的表達Fig 2 Expression of eEF2K protein and mRNA

2.2 STS聯合eEF2K-siRNA對肺腺癌A549細胞增殖的影響

與siRNA-NC組比較，siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細胞存活率、克隆形成率均明顯降低(P<0.05)，且siRNA-eEF2K+STS組細胞存活率和克隆形成率明顯低于siRNA-eEF2K組和siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖3，4)。

圖3 克隆形成實驗檢測結果Fig 3 Results of clonal formation test

*P<0.05 compared with siRNA-NC group; #P<0.05 compared with siRNA-eEF2K group; △P<0.05 compared with siRNA-NC+STS group圖4 各組A549細胞存活率和克隆形成率Fig 4 A549 cell survival rate and clone formation rate in each

2.3 STS聯合eEF2K-siRNA對肺腺癌A549細胞侵襲的影響

與siRNA-NC組比較，siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組中穿膜細胞數均明顯減少(P<0.05)，且siRNA-eEF2K+STS組中穿膜細胞數明顯少于siRNA-eEF2K組和siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖5，6)。

2.4 STS聯合eEF2K-siRNA對肺腺癌A549細胞遷移的影響

siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細胞遷移率較siRNA-NC組均明顯降低(P<0.05)，且siRNA-eEF2K+STS組細胞遷移率明顯低于siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖7)。

圖5 Transwell小室法檢測結果Fig 5 Transwell migration assay test results(×200)

*P<0.05 compared with siRNA-NC group; #P<0.05 compared with siRNA-eEF2K group; △P<0.05 compared with siRNA-NC+STS group圖6 各組中穿膜A549細胞數、遷移率Fig 6 Number of transmembrane A549 cells and cell migration rate in each

2.5 STS聯合eEF2K-siRNA對肺腺癌A549細胞凋亡的影響

siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細胞凋亡率較siRNA-NC組均明顯升高(P<0.05)，且siRNA-eEF2K+STS組細胞凋亡率明顯高于siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖8，9)。

2.6 STS聯合eEF2K-siRNA對肺腺癌A549細胞中AKT、p-AKT、Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達水平的影響

siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細胞中p-AKT、Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達水平明顯低于siRNA-NC組(P<0.05)，而siRNA-eEF2K+STS組細胞中上述各指標明顯低于siRNA-eEF2K組和siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖10，11)。

圖7 A549細胞劃痕實驗檢測結果Fig 7 Test results of scratch assay for A549 cells(×40)

圖8 各組A549細胞凋亡率Fig 8 Apoptosis rate of A549 cells in each group

*P<0.05 compared with siRNA-NC group; #P<0.05 compared with siRNA-eEF2K group; △P<0.05 comp-ared with siRNA-NC+STS group圖9 各組A549細胞凋亡率Fig 9 Apoptosis rate of A549 cells in each group

3 討論

越來越多的數據表明，eEF2K有助于腫瘤的發生發展，是癌潛在的治療靶點。eEF2K在食管鱗狀細胞癌中呈高表達狀態，可通過促進細胞增殖、侵襲和減少細胞凋亡促進食管鱗狀細胞癌的惡性進展[6]；eEF2K抑制劑可通過誘導細胞凋亡和自噬發揮抗乳腺癌的作用[7]。本研究轉染siRNA-eEF2K成功下調eEF2K表達后發現，肺腺癌A549細胞存活率、克隆形成率、穿膜細胞數和遷移率均明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，該結果與報道[3]吻合。提示eEF2K促進肺癌的發生發展，靶向干擾其表達可能是肺癌治療的重要策略。

丹參酮ⅡA是活血化瘀藥丹參的有效成分，具有良好的抗肺癌作用[8]， 還可提高化學藥物治療(化療)治療肺癌的臨床療效[9]。作為丹參酮ⅡA水溶性成分代表，STS與順鉑聯用可協同上調E-cadherin表達，抑制小鼠肺癌細胞侵襲轉移。然而，靶向抑制eEF2K表達和STS聯合作用是否可協同抗肺癌并不清楚。本研究結果表明，靶向抑制eEF2K聯合STS可協同抑制A549細胞增生。提示eEF2K沉默聯合STS具有協同抗肺癌的作用。

圖10 A549細胞中AKT、p-AKT、Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達Fig 10 Expression of AKT, p-AKT, Ki67, MMP-2 and Bcl-2 proteins in A549 cells

AKT處于PI3K/AKT通路的核心地位，其磷酸化激活后參與細胞增殖、凋亡等過程；Ki67是細胞增殖過程中的重要抗原，其表達水平可反映細胞增殖情況；MMP-2是基質金屬蛋白酶基因家族，參與細胞侵襲和遷移過程；Bcl-2參與調控線粒體凋亡途徑，具有抑制細胞凋亡的作用；AKT活化可調控Ki67、MMP-2和Bcl-2的表達，促進肺癌的發生發展[10-12]。研究顯示，靶向干擾eEF2K表達可降低AKT活性[13-14]；同時，丹參酮ⅡA也可通過抑制AKT活性增強吉非替尼對肺癌細胞的殺傷作用[15]。為了探討eEF2K基因沉默聯合STS協同抗肺癌的分子機制，本研究進一步檢測發現，eEF2K沉默聯合STS可協同抑制A549細胞中p-AKT及Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達。提示eEF2K沉默聯合STS發揮抗肺癌的作用可能是通過共同抑制p-AKT及Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白來實現的。

*P<0.05 compared with siRNA-NC group; #P<0.05 compared with siRNA-eEF2K group; △P<0.05 comp-ared with siRNA-NC+STS group圖11 各組A549小樂趣AKT、p-AKT、Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達水平Fig 11 Expression of AKT, p-AKT, Ki67, MMP-2 andBcl-2 proteins in each group of A549 cells

綜上所述，eEF2K沉默聯合STS可協同抑制A549細胞增殖、侵襲和遷移，其作用機制可能與共同抑制p-AKT、Ki67、MMP-2、Bcl-2蛋白表達有關。本研究只在肺腺癌A549細胞中初步探討了eEF2K沉默聯合STS抗肺癌的作用，后續還將在肺癌其他細胞株及移植瘤小鼠中進一步驗證，以期為肺癌化療耐藥及多靶點治療提供新線索。