丙泊酚抑制人子宮內膜癌細胞系RL95-2增殖

李勇曉，孫 燕，張瑞生

(鄭州市婦幼保健院 麻醉科，河南 鄭州 450000)

子宮內膜癌(endometrial carcinoma)為發生于子宮內膜上皮的惡性腫瘤，易發人群為絕經期及絕經后女性[1]。近年來，子宮內膜癌的發病率明顯上升，對于早期子宮內膜癌患者一般采取手術治療，對于無法手術或復發的子宮內膜癌患者大多采取放射治療和化學治療，但對患者正常身體機能的副作用較大。因此，探索新的治療策略對于子宮內膜癌的臨床治療具有重要意義。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是細胞增殖過程中的重要調節因子，它可由蛋白激酶B(protein kinase B, PKB，又稱Akt)啟動并活化，活化的mTOR調控下游效應蛋白核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1, S6K1)的表達，影響細胞周期從而調節細胞的增殖、凋亡等[2-3]。研究發現，mTOR信號通路的激活與腫瘤的不良預后有關[4]。抑制mTOR信號通路的激活，可在抗腫瘤方面起到重要作用，這也成為了一種預防和治療腫瘤的新策略[5-6]。丙泊酚(propofol)是一種短效的靜脈麻醉藥物，因其具有起效快、副作用小等優點而被廣泛應用于臨床中。近年來，研究者們發現丙泊酚可抑制癌細胞增殖并且誘導其凋亡，對腫瘤具有調控作用[7]。目前，關于丙泊酚對子宮內膜癌的作用鮮有報道。本研究采用丙泊酚干預子宮內膜癌細胞系細胞，以觀察癌細胞增殖及凋亡情況的變化，從分子水平上去探究丙泊酚對mTOR信號通路的影響，為子宮內膜癌治療提供一定的理論及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人子宮內膜癌細胞系RL95-2(武漢云克隆動物有限公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒：丙泊酚(propofol)(北京普天同創生物科技有限公司)；DMEM培養基和胎牛血清(FBS)(Hyclone公司)；二甲基亞砜(DMSO)、0.2%胰蛋白酶溶液和細胞裂解液(Invitrogen公司)；caspase-3和caspase-9活性測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(BD公司)；抗-Akt、-p-Akt、-mTOR、 -p-mTOR、 -S6K1和-p-S6K1抗體[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 實驗的分組及處理：將RL95-2細胞隨機分為：對照組：10 %胎牛血清+DMEM培養基培養、丙泊酚低(1.25 mmol/L)、中(2.5 mmol/L)和高劑量組(5 mmol/L)。每組10例，均在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h。

1.2.2 CCK-8法檢測RL95-2細胞增殖：將RL95-2細胞以濃度為2×104個/mL接種于96孔板中，加入10 μL的CCK-8溶液，繼續培養1 h，利用酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細胞增殖率%=丙泊酚處理組(A)/對照組(A)×100%。

1.2.3 克隆形成實驗檢測RL95-2細胞克隆形成：將RL95-2配制成濃度為1×106個/mL的單細胞懸液，2 mL/孔接種于6孔板中，培養24 h，棄去上層培養基并加入胰蛋白酶對細胞進行消化，加入新的培養基終止消化后，4 ℃、1 500 r/min離心10 min收集細胞。將各組細胞重懸并以1 000個/10 cm皿的密度接種于含DMEM培養基的平板培養皿中，37 ℃、5% CO2條件下培養2～3周，期間經常觀察，當出現肉眼可見的細胞克隆時，終止培養并對細胞進行固定和染色，顯微鏡下觀察并計數大于50個細胞的克隆數。克隆形成率%=克隆數/接種細胞數×100%。

1.2.4 流式細胞測量術檢測RL95-2細胞凋亡：將RL95-2以濃度為1×106個/mL接種于6孔板中，培養24 h，用胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞。無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌細胞2次，隨后用annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒中的緩沖液將細胞重懸，再次調整細胞濃度為1×106個/mL。取各組100 μL重懸后的細胞分別加入流式管中，做好分組標記，再向流式管中加入5 μL抗 annexin V-FITC抗體和抗5 μL annexin V-PI抗體，快速混合均勻后避光孵育15 min，加入400 μL緩沖液混勻后上樣流式細胞儀，分析細胞凋亡情況，注意全程冰上操作。

1.2.5 比色法檢測RL95-2細胞caspase-3和caspase-9活性：將RL95-2細胞以1×106個/mL的接種于細胞培養瓶中，加入胰蛋白酶對細胞進行消化，1 500 r/min離心10 min，棄去培養基，用無菌PBS洗滌1次，收集細胞并加入細胞裂解液作用15 min，4 ℃低溫10 000 r/min離心10 min。按照試劑盒說明書，取離心后上清液進行caspase-3和caspase-9活性測定，通過酶標儀測定405 nm吸光度(A)值。

1.2.6 蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測細胞Akt、mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平：將RL95-2細胞以濃度為1×106個/mL接種于6孔板中培養過夜。棄去培養基后用胰蛋白酶消化細胞，終止后低溫1 500 r/min離心10 min，無菌PBS洗滌細胞2次，再次離心棄上清，加入細胞裂解液，按照試劑盒說明書提取細胞總蛋白。蛋白定量后進行SDS-PAGE，小心取出凝膠并用蛋白轉膜儀進行PVDF轉膜，在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，加入稀釋(1∶1 000)的對應一抗，4 ℃搖床孵育過夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1∶2 000)的二抗溶液，室溫搖床1 h，洗膜3次，ECL顯色并用凝膠成像系統拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 丙泊酚對RL95-2細胞增殖的影響

當丙泊酚濃度為10 mmol/L時，RL95-2細胞增值率下降至77.36%±4.55%，說明丙泊酚濃度大于等于10 mmol/L會對RL95-2細胞有明顯的細胞毒性(表1)。因此，在后續試驗中將丙泊酚的濃度設定為：低(1.25 mmol/L)、中(2.5 mmol/L)和高劑量組(5 mmol/L)。

相比于對照組，丙泊酚各組RL95-2細胞增殖率和細胞克隆形成能力顯著降低(P<0.05)(圖1，表2)。

表1 不同濃度丙泊酚對RL95-2細胞增值率的影響

表2 丙泊酚對RL95-2細胞增殖率和細胞克隆形成能力的影響

2.2 丙泊酚對RL95-2細胞凋亡的影響

丙泊酚各組相比于對照組，RL95-2細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖2，表3)。

2.3 丙泊酚對RL95-2細胞caspase-3和caspase-9活性的影響

相比于對照組，丙泊酚各組RL95-2細胞caspase-3和caspase-9活性明顯升高(P<0.05)(表4)。

A.control group; B.propofol low dose group; C.propofol medium dose group; D.propofol high dose group圖1 丙泊酚對RL95-2細胞克隆形成能力的影響Fig 1 Effect of propofol on the clone formation ability of RL95-2 cells

A.control group; B.propofol low dose group; C.propofol medium dose group; D.propofol high dose group圖2 丙泊酚對RL95-2細胞凋亡的影響Fig 2 Effect of propofol on apoptosis of RL95-2 cells

表3 丙泊酚對RL95-2細胞凋亡的影響

表4 丙泊酚對RL95-2細胞caspase-3和caspase-9活性的影響

2.4 丙泊酚對RL95-2細胞Akt、mTOR、S6K1和STAT3蛋白磷酸化水平的影響

丙泊酚各組RL95-2細胞中Akt、mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平均顯著低于對照組(P<0.05)(圖3，表5)。

3 討論

子宮內膜癌是一種常見的女性生殖系統惡性腫瘤， 發病率僅次于宮頸癌和卵巢癌， 多見于55歲左

A.control group; B.propofol low dose group; C.propofol medium dose group; D.propofol high dose group圖3 丙泊酚對RL95-2細胞p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-S6K1和S6K1蛋白表達水平的影響Fig 3 Effects of propofol on the protein expressions of p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, p-S6K1 and S6K1 in RL95-2 cells

表5 丙泊酚對RL95-2細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-S6K1/S6K1水平的影響

右的絕經婦女。患者癥狀表現為出血、陰道排液、疼痛以及腹部包塊等。患者持續出血或會導致繼發性貧血；腫瘤擴散可于腹股溝等多處發現腫大的或融合的淋巴結轉移病灶；長期病痛和消耗使患者出現持續發熱、消瘦及惡病質等全身衰竭的表現[8]。目前，子宮內膜癌的發病率逐年升高，嚴重威脅女性身心健康。尋求安全高效的子宮內膜癌治療策略成為專家學者們亟待解決的問題。

丙泊酚為靜脈麻醉藥物，于80年代中期開始應用于臨床。鑒于其顯著的優勢：起效迅速、可控性強、維持時間短、蘇醒較快、副作用小并且無積蓄等，目前已被廣泛應用于臨床手術麻醉及鎮靜。近年來，發現丙泊酚參與許多與癌相關的病理生理過程，它可通過調節多種信號通路、下游分子和微小RNA等的表達，抑制腫瘤的生長和轉移；還可以增強化療藥物或一些小分子化合物的抗腫瘤作用[9-10]。研究報道，丙泊酚可抑制低氧誘導的食管癌細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化[11]。有報道[12]用丙泊酚對肺、結腸、神經膠質瘤、腎和卵巢癌細胞進行干預培養后發現，丙泊酚可下調細胞中的6個促癌基因、上調8個抗癌基因，并且干擾癌細胞的代謝，引起糖代謝紊亂，降低腫瘤的惡性程度。本研究結果表明，丙泊酚可抑制子宮內膜癌細胞的增殖和克隆形成能力，上調凋亡相關的caspase-3和caspase-9活性，促進細胞凋亡。提示，丙泊酚在子宮內膜癌中可起到抗腫瘤作用，在子宮內膜癌治療手術中用丙泊酚作為麻醉劑或可能改善患者預后。

研究報道，mTOR信號通路在多種人類腫瘤中存在高表達和高活化，如宮頸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結腸癌等，抑制mTOR在腫瘤治療中具有重要作用[13-14]。近年，隨著對mTOR信號通路的逐步研究，該通路在腫瘤相關發展進程(例如細胞增殖、新陳代謝和細胞凋亡等)中的機制日益清晰，靶向抑制mTOR信號通路的激活成為癌治療的一個較有潛力的研究方向。本研究結果顯示，丙泊酚干預后的子宮內膜癌細胞中Akt、mTOR和S6K1磷酸化水平均顯著降低。結合已有的研究報道[15]，抑制mTOR通路可下調其下游介質(如S6K1)的激活，引起細胞周期阻滯從而誘導癌細胞凋亡，推測本研究中，丙泊酚可能通過抑制mTOR信號通路的激活，誘導癌細胞凋亡。

綜上所述，丙泊酚可抑制子宮內膜癌細胞增殖，可能調控mTOR信號通路，降低S6K1蛋白活化水平，促進癌細胞凋亡。但丙泊酚對子宮內膜癌的臨床效用還需更多臨床驗證。