重組梅毒螺旋體蛋白Tp47通過誘導uPA增加血管內皮細胞通透性

于寶丹，陳 聰，柯吳堅，呂 萍*

(1.廣州醫科大學附屬第一醫院 檢驗科， 廣東 廣州 510120； 2.南方醫科大學皮膚病醫院 皮膚科， 廣東 廣州 510095)

梅毒是一種由梅毒螺旋體(Treponemapallidum，T.pallidum,Tp)感染引起的慢性傳染性疾病，可合并全身多系統的損害。許多研究證實，Tp通過黏附于宿主上皮細胞，穿透組織屏障，侵入內皮細胞之間的緊密連接，從而進入循環系統，導致全身廣泛播散[1]。因此，梅毒螺旋體穿透組織屏障是導致多組織器官感染的一個重要環節。既往已經發現神經梅毒患者腦脊液中的尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinse-plasminogen activator, uPA)顯著高于未累及神經系統的梅毒患者[2]，這一結果提示uPA可能在Tp穿透血腦屏障播散至中樞神經系統過程中發揮作用。梅毒螺旋體的外膜蛋白是 Tp 的主要免疫反應組分，能誘導機體產生較強的免疫應答[3]，其中梅毒螺旋體47 ku膜蛋白(Tp47) 含量高、免疫原性強，在梅毒的致病機制研究和臨床診斷中具有重要意義[4]。本研究構建了人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein/vascular endothelial cells,HUVECs)單層模型，通過觀察重組Tp特異性膜蛋白Tp47(recombinant Tp protein Tp47，rTpp47)對THP-1巨噬細胞合成uPA的調控及其對血管內皮細胞通透性的影響，進一步探討rTpp47在梅毒發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)和人單核-巨噬細胞系THP-1為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑：重組蛋白 Tpp47(rTpp47)由廣州洛孚生物科技有限責任公司合成，已去除內毒素，純度>90%；RPMI-1640培養基、胎牛血清、FITC 標記的葡聚糖(Gibco公司)；佛波酯(PMA)(索萊寶公司)；阿米洛利(amiloride)(Merck公司)；Transwell小室(Coning公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：HUVECs、THP-1 細胞均培養于含10%胎牛血清的 DMEM 培養基(含 0.05%的青鏈霉素雙抗)，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。

1.2.2 THP-1巨噬細胞的誘導：取生長良好的對數期THP-1細胞， 1 000 r/min離心5 min，棄上清，新鮮培養基重懸細胞，顯微鏡下計數調整細胞濃度為1×106個/mL鋪于6孔板內，同時加入終濃度為100 ng/mL的佛波酯(PMA)繼續培養48 h，誘導為貼壁的THP-1巨噬細胞。

1.2.3 不同濃度rTpp47與THP-1細胞共培養：取PMA刺激48 h后的THP-1細胞接種于6孔板，細胞數為3×105個/孔，然后加入不同濃度的rTpp47(分別為0.1、0.5和1 μg/mL)，培養24 h后集培養上清，1 000 r/min離心5 min后取上清液，用離心沉淀的細胞提取細胞蛋白，分別用ELISA和Western blot檢測uPA表達。另取一組THP-1細胞接種于6孔板，同時加入rTpp47(0.5 μg/mL)和uPA合成抑制劑阿米洛利(分別為0、50、100、200 μmol/L)，培養24 h后收集細胞培養上清檢測uPA含量。

1.2.4 Transwell 細胞共培養實驗：取對數期生長的HUVECs鋪于Transwell小室6孔板的下室，細胞濃度為3×105個/mL/孔，24 h后更換培養基，并在Transwell上室加入PMA誘導后的THP-1細胞，每孔加入THP-1細胞3×105個，每孔培養基總體積為2.5 mL。共培養的細胞分成3組，分別為uPA合成抑制劑阿米洛利組(50 μmol/L)、rTpp47(0.5 μg/mL)組以及rTpp47(0.5 μg/mL)+阿米洛利(50 μmol/L)組。共培養24 h后，收集下室的HUVECs，提取細胞蛋白。

1.2.5 用 FITC 標記的葡聚糖漏出法測定 HUVECs相對通透性：將HUVECs按照2×105個/孔接種于已鋪鼠尾膠原的Transwell (24孔板，孔徑為3 μm)上室，200 μL細胞懸液，Transwell下室添加700 μL完全培養基。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況并且全量換液，細胞生長至2 d后已達到完全匯合，棄去培養基，在每個Transwell上下室分別加入rTpp47(0.5 μg/mL)刺激24 h后的THP-1細胞條件培養基，以不加rTpp47(0.5 μg/mL)刺激的THP-1細胞條件培養基作為對照組，分別作用6、12及24 h后，無菌PBS沖洗3次，在Transwell上室加入終濃度為1 mg/mL的 FITC-葡聚糖200 μL，下室更換為無菌PBS 700 μL，從下室取樣品100 μL，即為t=0 的樣品，培養箱內繼續孵育30 min，在每個下室取樣品100 μL，即t=30min的樣品。避光保存，待樣品收集完全后置于96孔板中，用多功能酶標儀測定熒光強度，激發波長為490 nm，發射波長為520 nm，檢測滲透到下室的FITC-葡聚糖的熒光強度，通過計算t=30 min的熒光強度與t=0時的熒光強度之比判斷內皮細胞的通透性。

1.2.6 ELISA檢測細胞上清中的uPA含量：實驗前0.5 h，將試劑盒恢復至室溫，每孔加入100 μL稀釋液，然后分別加入50 μL的標準品、空白對照和待檢樣品，室溫下搖床(500 r/min)孵育2 h。然后移棄液體，洗板4次，在吸水紙上拍干，每孔加入200 μL的uPA 偶聯物，用封板膜封板后放置搖床室溫孵育2 h，洗板后加入200 μL底物，室溫、避光孵育30 min，每孔加入50 μL終止液，5 min內于酶標儀450 nm處，以空白對照孔調零后檢測各個孔吸光度(A)值。根據標準品濃度及校準后的A值制作出標準曲線方程，再根據所測樣品的校準后A值，用標準曲線方程計算出樣品的蛋白濃度。

1.2.7 Western blot實驗：收集培養的細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min。裂解上清行SDS-PAGE。將蛋白轉移到PVDF膜上后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)兔抗鼠uPA、p-PKC、PKC、GAPDH、claudin-5抗體，4 ℃緩慢振蕩過夜。洗膜3次，加入辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，37 ℃緩慢振蕩1 h。ECL化學發光法試劑作用于PVDF膜5 min，曝光膠片。用 Image-J軟件進行灰度值分析，以目的蛋白與GAPDH的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 rTpp47對THP-1巨噬細胞表達和分泌uPA的影響

隨著rTpp47濃度的升高，THP-1細胞內表達的uPA也逐漸增多(圖1A,B)，細胞培養上清中的uPA含量也逐漸升高(圖1C)。0.5 μg/mL的rTpp47刺激THP-1細胞分泌的uPA顯著高于對照組(P<0.05)。1 μg/mL的rTpp47組uPA的含量高于0.5 μg/mL的rTpp47組，但兩者差異無統計學意義，因此，后續實驗采用0.5 μg/mL的rTpp47。

2.2 rTpp47與THP-1巨噬細胞共培養的上清液對單層血管內皮細胞(HUVECs)通透性的影響

6 h的實驗組與對照組血管內皮細胞相對通透性差異無統計學意義，12和24 h對照組與實驗組的血管內皮細胞相對通透性差異明顯(P<0.05 和P<0.000 1)(圖2)。

2.3 阿米洛利對THP-1細胞分泌uPA的抑制作用

50 μmol/L的阿米洛利顯著抑制了rTpp47刺激THP-1細胞分泌uPA的功能(P<0.000 1)，并且阿米洛利的抑制作用呈濃度依賴性(圖3)?？紤]到高濃度阿米洛利的細胞毒作用，后續實驗采用低濃度的50 μmol/L的阿米洛利。

2.4 THP-1分泌的uPA對HUVECs緊密連接蛋白claudin-5表達的影響

0.5 μg/mL的rTpp47顯著抑制了HUVECs的claudin-5蛋白表達，而50 μmol/L的阿米洛利也改善了rTpp47對HUVECs的claudin-5蛋白表達的抑制作用(P<0.05)(圖4)。

A.representative pictures of Western blot; B.uPA expressed in THP-1 cells gradually increased when the concentration of rTpp47 increased,*P<0.05 compared with 0 μg/mL; C.uPA secreted by THP-1 cells gradually increased when the concentration of rTpp47 increased by ELISA; *P<0.05/0.001 compared with 0 μg/mL

*P<0.05, **P<0.000 1 compared with control group圖2 rTpp47與THP-1巨噬細胞共培養的上清液促進單層血管內皮細胞(HUVECs)通透性升高Fig 2 Supernatant of the co-culture of rTpp47 and THP-1 macrophages promoted the increase of the permeability of monolayer vascular end-

*P<0.05 compared with 100 μmol/L amiloride group; #P<0.000 1 compared with 0 μmol/L amiloride group圖3 uPA活性抑制劑抑制THP-1細胞分泌uPAFig 3 uPA activity inhibitor suppressed the secretion of uPA by THP-1 n=3)

2.5 PKC信號通路參與rTpp47誘導的THP-1細胞表達uPA

rTpp47誘導的THP-1細胞表達uPA的同時，THP-1細胞內磷酸化PKC顯著增多(P<0.05)，uPA活性抑制劑阿米洛利顯著抑制了rTpp47誘導的THP-1細胞表達uPA和PKC的磷酸化(P<0.05)(圖5)。

3 討論

梅毒的發病機制尚不清楚，其與細胞免疫學密切相關。Tp膜蛋白可激活炎性反應細胞，釋放炎性介質、細胞因子，造成組織損傷或誘導宿主細胞凋亡。血管內皮屏障是由內皮細胞單層和基膜組成的通透屏障，控制血管內外物質交換。炎性介質、病原微生物及其代謝成分均可損傷內皮屏障功能，引起組織、器官水腫和功能障礙[5-6]。有研究顯示Tp侵入人體后出現局部的單核巨噬細胞浸潤[7]。

本研究利用rTpp47刺激THP-1巨噬細胞，觀察巨噬細胞表達和分泌uPA的影響，以及uPA對血管內皮細胞通透性的影響。本研究結果顯示 rTpp47顯著刺激THP-1細胞合成和分泌uPA，并且呈劑量依賴關系；rTpp47與THP-1巨噬細胞共培養的上清液促進單層血管內皮細胞通透性顯著升高，并且THP-1細胞與HUVECs共培養情況下，HUVECs緊密連接蛋白claudin-5表達顯著下調，而uPA活性抑制劑阿米洛利改善了rTpp47對HUVECs的claudin-5蛋白表達的抑制。據此推測rTpp47可能刺激THP-1細胞分泌uPA，而uPA 損傷了血管內皮細胞屏障中的緊密連接蛋白claudin-5，導致單層血管內皮細胞通透性升高。單層血管內皮的屏障功能是通過細胞間以及細胞與胞外基質的連接物質共同調節的[8]。內皮間的緊密連接和連接蛋白的特性決定細胞連接的通透性，其中緊密連接組織結構完整性起到重要作用[9]。Claudin-5 是緊密連接蛋白 claudins 家族的蛋白質成員，參與內皮緊密連接的必需膜蛋白, 是內皮細胞功能障礙的指標[10-11]，其表達過少或者重新分布，與內皮細胞的高通透性有關。

A.representative pictures of Western blot; B.relative expression of claudn-5 in HUVECs; *P<0.05 compared with amiloride; #P<0.05 compared with rTpp47+amiloride

A.representative pictures of Western blot; B.relative expression of uPA in THP-1 cells; C.relative expression of p-PKC in THP-1 cells; *P<0.05 compared with amiloride; #P<0.05 compared with rTpp47+amiloride

有研究發現，PKC信號通路在膿毒血癥誘導的uPA激活中發揮了重要作用[12]，PKC信號通路激活介導了人結腸癌細胞表達uPA[13]。本結果顯示，rTpp47誘導的THP-1細胞表達uPA的同時，THP-1細胞內磷酸化PKC顯著增多，uPA活性抑制劑阿米洛利抑制了rTpp47誘導的THP-1細胞表達uPA和PKC的磷酸化，證實PKC信號通路參與THP-1細胞合成uPA相關。

本研究顯示，梅毒螺旋體膜蛋白 Tp47 通過PKC信號途徑，在體外激活THP-1巨噬細胞，促進其合成和分泌uPA，增強損傷血管內皮細胞通透性，這在梅毒發病的免疫學發病機制中可能起重要作用。 進一步研究膜蛋白 Tp47 在炎性細胞激活和內皮細胞損傷中的作用，將對深入研究梅毒的免疫學發病機制具有重要的意義。