響應(yīng)面法優(yōu)化四妙勇安湯菌質(zhì)固態(tài)發(fā)酵工藝?

馬新?lián)Q，李季文，畢映燕，王雪梅

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

四妙勇安湯的處方最先記錄于華佗的《神醫(yī)秘傳》，曰“此疾發(fā)于手指或足恥之端，先疹然后痛，甲現(xiàn)玄色，久則潰敗，節(jié)節(jié)脫落……內(nèi)服藥用玄參三兩，金銀花三兩，當(dāng)歸二兩，甘草一兩，水煎服。”清朝醫(yī)家鮑相敖將此方命名為“四妙勇安湯”，收載于《驗(yàn)方新編》中，并稱其醫(yī)治脫疽“連續(xù)十劑，永無后患”［1］。目前臨床上不僅僅用四妙勇安治外科脫疽，其在周圍血管病科、骨科、眼科也廣泛應(yīng)用［2-9］。真菌發(fā)酵可以富集中藥成分，不僅可減少藥材用量，還可提高療效［10］。筆者通過查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，利用藥用真菌進(jìn)行中藥發(fā)酵亦可組成中藥復(fù)方，通過其分解轉(zhuǎn)化能力，提高中藥中活性成分的單位濃度，且可產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，獲取更多的有效成分，共同作用于機(jī)體，發(fā)揮整體效應(yīng)［11-13］。本文通過真菌發(fā)酵技術(shù)，對(duì)四妙勇安湯方進(jìn)行發(fā)酵研究，以期實(shí)現(xiàn)減少服用量，提高臨床療效的目的。通過本研究初步建立四妙勇安湯方菌質(zhì)真菌發(fā)酵工藝條件，旨在為四妙勇安湯的開發(fā)研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器儀器YX280A 型手提式不銹鋼蒸汽消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；SB-5200DTS雙頻超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-S4 型恒溫水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；MJX-160 型培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；HXGZ-000800 電熱恒溫干燥箱（連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠）；BS110 電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 材料真菌菌種由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心研發(fā)部自制。金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb. 的干燥花蕾或帶初開的花；玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根；當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根；甘草為豆科植物脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat. 的干燥根和根莖；均由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心提供，由甘肅省中醫(yī)院主任中藥師李喜香鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 發(fā)酵方法

2.1.1 菌種培養(yǎng)將真菌菌種接入121℃、滅菌30 min 的四妙勇安湯方藥材培養(yǎng)基中，于25℃下恒溫培養(yǎng)15天待菌絲體達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，即得。

2.1.2 菌質(zhì)的制備取金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草飲片，破碎，加入適量的蒸餾水，混合均勻，置于100 mL 試管內(nèi)，蓋上棉塞，用包裝紙包好，121℃，滅菌30 min。在無菌室內(nèi)，取制備好的固體種子適量平鋪接種到固體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度、濕度下，培養(yǎng)，至發(fā)酵瓶底布滿菌絲，即得。

2.1.3 菌絲體生長(zhǎng)速度以S 代表每天菌絲生長(zhǎng)速度（mm），以菌絲體布滿菌質(zhì)表面開始計(jì)算，平行3 份（A1、A2、A3），將發(fā)酵瓶圓形面平均分成4 份，分別測(cè)定菌絲體生長(zhǎng)速度（S1、S2、S3、S4）。計(jì)算公式為：

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 藥材粒徑對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照飲片、10目、24目、50目、60 目的要求混合，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì)，菌質(zhì)裝至同一高度，菌質(zhì)條件為含水量為120%，接種量為10%，在27℃，發(fā)酵15天。考察不同粒徑對(duì)菌絲體生長(zhǎng)速度的影響。隨著目數(shù)的增加菌絲體生長(zhǎng)速度減慢，結(jié)果顯示10 目培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)速度快。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中藥材粒徑選為10目。

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照5、10、15、20、30 天的要求培養(yǎng)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì)，菌質(zhì)條件為菌質(zhì)粒徑為10 目，含水量為120%，接種量為10%，在27℃，發(fā)酵不同天數(shù)。考察發(fā)酵時(shí)間，結(jié)果顯示15天為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照20、22、24、26、8℃的要求進(jìn)行培養(yǎng)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì)，菌質(zhì)條件為菌質(zhì)粒徑為10 目，含水量為120%，接種量為10%，在按照不同溫度，發(fā)酵15天。考察發(fā)酵溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示24℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.2.4 菌質(zhì)初始含水量對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照初始含水量90%、100%、110%、120%、130% 的要求進(jìn)行培養(yǎng)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì)，菌質(zhì)條件為菌質(zhì)粒徑為10 目，接種量為10%，發(fā)酵溫度為24℃，在按照不同初始含水量，發(fā)酵15 天。考察初始含水量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示100% 為最佳初始含水量。

2.2.5 接種量對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照5%、7%、9%、10%、15% 的接種量要求進(jìn)行接種培養(yǎng)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì)，菌質(zhì)條件為菌質(zhì)粒徑為10 目，初始含水量為100%，發(fā)酵溫度為26℃，在按照不同接種量，發(fā)酵15 天。考察初始含水量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示10%為最佳接種量。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法[14-21]

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)主要研究初始含水量（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）3 個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值菌絲生長(zhǎng)速度（S）的影響。采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)分析方法，優(yōu)化工藝條件，并進(jìn)行預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)分析。因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

2.3.2 模型建立及回歸分析采用Design Expert 8.0.6軟件，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程為S=11.02+0.67A+1.39B+2.27C+1.18AB+0.98AC+0.94BC-2.23A2-1.44B2-0.13C2，相關(guān)系數(shù)R2=0.8169，表明方程擬合情況良好。方差分析見表3。式中S 為菌絲體生長(zhǎng)速度（mm），A 初始含水量（%）、B發(fā)酵溫度（℃）、C接種量（g）。見表3。

表2 菌絲生長(zhǎng)速度

從表3 可以看出，模型的P＜0.01，說明該模型得到的回歸方程有高度顯著性差異，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.8169，進(jìn)一步說明模型具有較好的可信度。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)結(jié)果的影響排序，接種量＞發(fā)酵溫度＞初始含水量。方差分析的結(jié)果表明方程的總模型、發(fā)酵溫度（B）及接種量（C）對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響有顯著性；初始含水量（A）對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度無影響，而交互項(xiàng)AB、AC、BC 對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響不顯著。

表3 回歸方程的方差分析表

2.3.3 效應(yīng)面分析響應(yīng)面優(yōu)化法即是將實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到的預(yù)測(cè)模型一般是個(gè)曲面，即所獲得的預(yù)測(cè)模型是連續(xù)的。其優(yōu)勢(shì)是在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過程中，可以連續(xù)的對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析。

2.4 條件優(yōu)化、預(yù)測(cè)與驗(yàn)證由圖1—3 響應(yīng)面可知該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。利用Point Prediction 進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，獲得一組響應(yīng)值最大的優(yōu)化條件：初始含水量124.5%，發(fā)酵溫度為28℃，接種量為10%，在此優(yōu)化條件下，菌絲生長(zhǎng)速度S 為14.94 mm。為了方便實(shí)際加水量操作，將發(fā)酵工藝參數(shù)適當(dāng)調(diào)整為：初始含水量125%，發(fā)酵溫度為28℃，接種量為10%。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，依法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度，對(duì)修正結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果菌絲生長(zhǎng)速度為14.66 mm（n=3）。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間偏差不大，說明該工藝參數(shù)在菌芪菌質(zhì)發(fā)酵工藝中具有可靠性和重現(xiàn)性。

圖1 初始含水量和發(fā)酵溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的等高線及響應(yīng)面圖

圖2 初始含水量和接種量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的等高線及響應(yīng)面圖

圖3 發(fā)酵溫度和接種量對(duì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的等高線及響應(yīng)面圖

3 討論

本試驗(yàn)在研究過程中，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，明確中藥菌質(zhì)的粒徑，并將其粒徑確定為10 目，均值太粗，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)的時(shí)間太長(zhǎng)，菌質(zhì)太細(xì)不利于后續(xù)的提取。故在確定菌質(zhì)粒徑的前提下，經(jīng)過發(fā)酵天數(shù)的觀察，明確了發(fā)酵15 天可達(dá)到發(fā)酵終。本試驗(yàn)應(yīng)用菌株具有分解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉等成分的作用，在該試驗(yàn)研究過程中有利于富集四妙勇安湯方中的有效成分，在臨床使用中減少服用量，同時(shí)提高療效。本試驗(yàn)以四妙勇安湯方藥材為菌質(zhì)對(duì)其進(jìn)行雙向固態(tài)發(fā)酵工藝研究，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化條件結(jié)果表明，初始含水量（A）及接種量（C）對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響有顯著性；發(fā)酵溫度（B）對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度無影響，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間偏差不大，說明該工藝參數(shù)在四妙勇安湯菌質(zhì)發(fā)酵工藝中具有可行性。