檸檬醛型黃樟莖段組織培養(yǎng)研究

肖祖飛，王文秀，魏 希，張北紅，李 鳳，金志農(nóng)

（南昌工程學(xué)院 江西省樟樹(shù)繁育與開(kāi)發(fā)利用工程研究中心，江西南昌 330099）

檸檬醛是香料產(chǎn)業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)迫切需要的原料。天然檸檬醛主要從山蒼子（Litsea cubeba）種子中提取得到，產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高，滿足不了市場(chǎng)需求。近年來(lái)，在黃樟（Cinnamomum porrectum）中發(fā)現(xiàn)了富含檸檬醛的優(yōu)良單株，為天然檸檬醛的生產(chǎn)找到了新來(lái)源。檸檬醛型黃樟采用矮林栽培，1年采伐1次或2年采伐3次枝葉，可極大地提高檸檬醛產(chǎn)量，滿足市場(chǎng)需求。以生產(chǎn)精油為目的，種植黃樟矮林在江西、廣西和云南等地盛行，優(yōu)良檸檬醛型黃樟苗木極其短缺，制約著以檸檬醛為原料林的香精香料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。快速繁殖優(yōu)良檸檬醛型黃樟種苗是當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。黃樟的主要繁殖方式是種子繁殖[1-2]和扦插[3-5]。黃樟經(jīng)種子繁殖，后代性狀分離嚴(yán)重，多數(shù)劣變，降低精油產(chǎn)量和質(zhì)量。黃樟扦插具有明顯的年齡效應(yīng)和位置效應(yīng)，扦插生根率較低。莖段組織培養(yǎng)具有繁殖速度快、系數(shù)高和能保持母本優(yōu)良性狀等優(yōu)點(diǎn)，是苗木快繁的重要方式。有研究表明，黃樟組織培養(yǎng)最佳基本培養(yǎng)基為改良MS 培養(yǎng)基（0.8 g∕L NH4NO3、0.2 g∕L Ca(NO3)2·4H2O），腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基為改良MS+4.0 mg∕L 6-BA+0.5 mg∕L NAA，增殖培養(yǎng)基為改良MS+2.0 mg∕L 6-BA + 0.5 mg∕L NAA，生根培養(yǎng)基為改良1∕2 MS +0.5 mg∕L IBA + 0.5 mg∕L IAA[6]。關(guān)于黃樟組織培養(yǎng)技術(shù)的研究還處于起步階段。本研究以檸檬醛型黃樟2年生扦插苗半木質(zhì)化枝條為材料，研究消毒時(shí)間、采集時(shí)間和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)檸檬醛型黃樟莖段組織培養(yǎng)的影響，為檸檬醛型黃樟的無(wú)性快繁提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為檸檬醛型黃樟2年生扦插苗半木質(zhì)化枝條，剪成帶1～2 個(gè)芽的莖段（1.5～3 cm），用自來(lái)水沖洗2 h，置于超凈工作臺(tái)，用質(zhì)量濃度75%酒精（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn)）浸泡30 s，無(wú)菌水清洗3～5次，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 消毒時(shí)間對(duì)莖段組織培養(yǎng)的影響

2020年5月中旬，將上述處理好的莖段用質(zhì)量濃度0.1%的HgCl2（河北省邢臺(tái)興教化工廠生產(chǎn)）消毒，消毒時(shí)間分別為3、5、7 和9 min，之后接種在添加1.0 mg∕L 6-BA 和0.05 mg∕L IBA 的MS 培養(yǎng)基上。每瓶接種1 個(gè)莖段，每處理30～35 瓶，3 次重復(fù)。接種30 天后，統(tǒng)計(jì)莖段的萌芽率、污染率和褐化率。

1.2.2 采集時(shí)間對(duì)莖段組織培養(yǎng)的影響

2020年5、7 和9月，分別采集枝條，按照1.1 的方法制作成莖段，用質(zhì)量濃度0.1%的HgCl2消毒5 min，之后接種在添加1.0 mg∕L 6-BA 和0.05 mg∕L IBA的MS培養(yǎng)基上。每瓶接種1個(gè)莖段，每處理30～35 瓶，3 次重復(fù)。接種30 天后，統(tǒng)計(jì)莖段的萌芽率、污染率和褐化率。

1.2.3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)莖段萌芽的影響

于1.2.2篩選所得到的最適采集時(shí)間采集枝條，按照1.1 的方法制作成莖段，用質(zhì)量濃度0.1%的HgCl2消毒，消毒時(shí)間為5 min，之后接種在添加6-BA（0.5、0.75、1.0 和1.25 mg∕L）和IBA（0.15、0.3、0.45和0.6 mg∕L）的MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行初代培養(yǎng)。每瓶接種1個(gè)莖段，每處理30～35瓶，3次重復(fù)。30天后統(tǒng)計(jì)萌芽率和萌芽莖段數(shù)。

1.2.4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)莖段增殖培養(yǎng)的影響

2020年12月，挑選生長(zhǎng)健壯、葉片舒展光亮和株高3～5 cm 的無(wú)菌苗，修剪成1.5 cm 長(zhǎng)的莖段，莖段至少帶有1葉1芽，接種到MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基分別添加6-BA（0.5、1.0、1.5 和2.0 mg∕L）和IBA（0.05、0.1、0.15 和0.2 mg∕L）。每處理20瓶，每瓶接種6～7個(gè)莖段。30天后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)、株高和莖粗。

1.2.5 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗生根培養(yǎng)的影響

2021年2月，挑選生長(zhǎng)健壯、葉片舒展光亮和株高3～ 5 cm 的無(wú)菌苗接種于1∕2 MS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基分別添加IBA（0.5、1.0、1.5 和2.0 mg∕L）和NAA（0.5、1.0、1.5 和2.0 mg∕L）。每處理20 瓶，每瓶接種7～10株。30天后統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)和根粗。

1.2.6 組培苗的煉苗和移栽技術(shù)

生根培養(yǎng)11 ～ 15 天，移至透光率20% ～ 35%、溫度25～30 ℃的大棚內(nèi)煉苗7～10 天，之后將組培苗移出瓶外進(jìn)行移栽。以紅壤土和草木灰（v∶v=5∶1）為基質(zhì)，移栽前將組培苗用質(zhì)量濃度0.5%多菌靈消毒10～15 min，之后移入裝滿基質(zhì)的無(wú)紡布袋中央。移栽后20天內(nèi)保持空氣濕度90%以上，基質(zhì)保持濕潤(rùn)，見(jiàn)干即澆，每次要澆透。移栽兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.2.7 組培苗的培養(yǎng)條件

MS 和1∕2 MS 培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g∕L（西隴科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)）、瓊脂粉7.0 g∕L（北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)），1∕2MS 培養(yǎng)基添加2 g∕L 活性炭（東莞市光華活性炭有限公司生產(chǎn)），pH 5.8。組培苗培養(yǎng)條件為白質(zhì)光、光強(qiáng)3 000～5 000 lx、光照時(shí)間12 h∕d、溫度（25±2）℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 軟件錄入、整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)莖段組織培養(yǎng)的影響

消毒5 ～ 9 min，污染率均低于20%，顯著低于3 min（67.35%）（P＜0.05）；消毒5～7 min，污染率差異不顯著（表1）。消毒3 ～ 7 min，褐化率均低于20%，顯著小于9 min（57.19%）（P＜0.05）。消毒5 min，莖段的萌芽率最高（58.16%），顯著高于其他消毒時(shí)間（P＜0.05）。采集檸檬醛型黃樟半木質(zhì)化莖段，用0.1%的HgCl2消毒，最適時(shí)間為5 min。

表1 消毒時(shí)間對(duì)莖段培養(yǎng)的影響Tab.1 Effects of disinfection time on stem segment culture

2.2 采集時(shí)間對(duì)莖段組織培養(yǎng)的影響

7 和9月的污染率和褐化率顯著高于5月（P＜0.05），萌芽率顯著低于5月（P＜0.05）（表2）。與5月相比，7 和9月的污染率分別高出35.23% 和154.29%，褐化率分別高出70.37%和160%，萌芽率分別降低27.53%和64.94%。5月采集枝條進(jìn)行初代培養(yǎng)，莖段容易成活。

表2 采集時(shí)間對(duì)莖段培養(yǎng)的影響Tab.2 Effects of collection time on stem segment culture

2.3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)莖段萌芽誘導(dǎo)的影響

IBA 濃度為0.15 mg∕L 時(shí)，萌芽莖段數(shù)和萌芽率隨6-BA 濃度升高呈先增加后降低的趨勢(shì)；6-BA 濃度為1.0 mg∕L 時(shí)，萌芽莖段數(shù)和萌芽率隨IBA 濃度升高而降低（表3）。MS+1.0 mg∕L 6-BA+0.15 mg∕L IBA 培養(yǎng)基的萌芽莖段數(shù)最多（21 條），萌芽率最高（70.00%）；MS + 0.5 mg∕L 6-BA + 0.15 mg∕L IBA培養(yǎng)基的萌芽莖段數(shù)最少（4 條），萌芽率最低（13.33%）。莖段萌芽最適培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg∕L 6-BA+0.15 mg∕L IBA（圖1）。

表3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)莖段萌芽誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of growth regulators on germination induction of stem segments

2.4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗增殖培養(yǎng)的影響

IBA 濃度為0.05 mg∕L 時(shí)，增殖系數(shù)隨6-BA 濃度升高而增大；6-BA 濃度為1.0 mg∕L 時(shí)，增殖系數(shù)隨IBA濃度升高而減小。MS + 2.0 mg∕L 6-BA +0.05 mg∕L IBA 培養(yǎng)基組培苗的增殖系數(shù)最大（3.55），其次為MS+1.0 mg∕L 6-BA+0.05 mg∕L IBA（3.52），MS + 1.0 mg∕L 6-BA + 0.2 mg∕L IBA 最小（2.32）（表4）。6-BA 濃度為1.0 mg∕L 時(shí)，株高隨IBA濃度升高而增 大，MS + 1.0 mg∕L 6-BA + 0.2 mg∕L IBA的株高最高（3.54 cm）。各處理間莖粗差異不顯著。以增殖系數(shù)為主要選擇指標(biāo)，組培苗最適增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg∕L 6-BA+0.05 mg∕L IBA，其次為MS+1.0 mg∕L 6-BA+0.05 mg∕L IBA。

表4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗增殖培養(yǎng)的影響Tab.4 Effects of growth regulators on proliferation of tissue culture seedling

2.5 檸檬醛型黃樟組培苗生根研究

2.5.1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗生根的影響

IBA 對(duì)組培苗生根有顯著的促進(jìn)作用，生根率隨IBA 濃度升高呈增大趨勢(shì)。1.0、1.5 和2.0 mg∕L IBA 處理的生根率均高于85%，三者間差異不顯著，顯著高于0.5 mg∕L IBA 處理（P＜0.05）（表5）。IBA濃度對(duì)根數(shù)、根長(zhǎng)和根粗影響不顯著。

NAA 對(duì)組培苗生根有顯著的促進(jìn)作用，生根率隨NAA 濃度升高呈增大趨勢(shì)。1.5 和2.0 mg∕L NAA處理的生根率達(dá)到90%以上，兩者間差異不顯著，顯著高于0.5 和1.0 mg∕L NAA 處理（P＜0.05）（表5）。1.5 和2.0 mg∕L NAA 處理組培苗的根數(shù)分別為3.17 和3.15，顯著高于0.5 和1.0 mg∕L NAA 處理（P＜0.05）。1.0 mg∕L NAA 處理的根長(zhǎng)最長(zhǎng)（6.52 cm），與1.5 和2.0 mg∕L NAA 處理差異不顯著，顯著高于0.5 mg∕L NAA 處理（P＜0.05）。各處理間的根粗差異不顯著。生根最適培養(yǎng)基為1∕2 MS + 1.5 mg∕L NAA，其次為1∕2 MS+2.0 mg∕L NAA。

表5 IBA濃度對(duì)組培苗生根的影響Tab.5 Effects of IBA concentrations on rooting of tissue culture seedling

2.5.2 組培苗生根過(guò)程基部形態(tài)變化

組培苗生根培養(yǎng)1～5天時(shí)，組培苗基部形態(tài)變化不明顯；生根培養(yǎng)7 天時(shí)，少數(shù)組培苗的基部切口愈合并開(kāi)始膨大；生根培養(yǎng)9 天時(shí)，大部分組培苗基部切口愈合并膨大，表皮有凸起點(diǎn)；生根培養(yǎng)11 天時(shí)，部分組培苗出現(xiàn)不定根；生根培養(yǎng)14天時(shí)，組培苗的不定根數(shù)量增多，并增長(zhǎng)和增粗（圖1）。

圖1 1.5 mg/L NAA誘導(dǎo)檸檬醛型黃樟組培苗生根過(guò)程Fig.1 Rooting process of tissue culture seedling of C.porrectum induced by 1.5 mg/L NAA

表6 NAA濃度對(duì)組培苗生根的影響Tab.6 Effects of NAA concentrations on rooting of tissue culture seedling

2.6 生根苗的煉苗和移栽研究

通過(guò)大棚內(nèi)7～10天的瓶?jī)?nèi)煉苗，移栽到瓶外，在塑料薄膜小拱棚緩苗20天，組培苗移栽成活率可達(dá)91.33%。待苗木長(zhǎng)到20 ～ 30 cm，莖木質(zhì)化后可將其移入大田定植。

3 結(jié)論與討論

采集時(shí)間不同，枝條生理狀況和成熟程度也不同，成活率會(huì)受到影響。消毒時(shí)間太短，消毒不徹底，可能會(huì)有細(xì)菌、真菌和微生物殘留，污染率升高；消毒時(shí)間太長(zhǎng)，對(duì)枝條本身傷害較大，褐化嚴(yán)重。本研究表明，5月中旬采集的半木質(zhì)化枝條，用0.1%的HgCl2消毒5 min，接種到MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)后，污染率較低，褐化率最低，萌芽率最高。與肖祖飛等[7]、張新超等[8]和王鋒等[9]研究結(jié)果一致。原因可能是消毒5min 能有效地消除枝條外表面的細(xì)菌和真菌，污染率低；對(duì)枝條的細(xì)胞傷害較小，褐化率低。5月中旬枝條新陳代謝旺盛、生命力強(qiáng)，內(nèi)源激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等含量高，組織幼嫩且容易分化。新長(zhǎng)出來(lái)的外植體與外界環(huán)境接觸時(shí)間短，受灰塵、細(xì)菌和真菌等污染少，容易消毒。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在組培苗的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，植物組織培養(yǎng)過(guò)程中使用最廣泛的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是6-BA、NAA 和IBA[10-12]。本研究表明，6-BA、IBA 和6-BA∕IBA 在檸檬醛型黃樟莖段的萌芽及組培苗增殖和生根過(guò)程中起重要作用。IBA濃度不變時(shí)，萌芽率隨6-BA 濃度增加呈先增加后降低的趨勢(shì)；6-BA 濃度不變時(shí)，萌芽率隨IBA 濃度增加而降低。增殖系數(shù)隨6-BA 和IBA 的比值升高而增大，6-BA∕IBA 為5時(shí)，增殖系數(shù)最小，6-BA∕IBA為40 時(shí)，增殖系數(shù)最大，說(shuō)明6-BA 在莖段萌芽誘導(dǎo)、組培苗增殖過(guò)程中起主要作用，這與辜夕容等[13]、彭東輝[14]和王長(zhǎng)憲等[15]研究結(jié)果一致。原因可能是6-BA 主要功能是誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，較高濃度的6-BA可促進(jìn)細(xì)胞快速分裂，與低濃度的IBA配合使用效果更好。IBA 和NAA 對(duì)組培苗的生根均有顯著促進(jìn)作用，NAA對(duì)組培苗的生根效果優(yōu)于IBA，1.5 mg∕L NAA 處理的生根率達(dá)到95%。在本試驗(yàn)過(guò)程中，6-BA、IBA 和NAA 對(duì)莖段的萌芽、組培苗增殖和生根的影響均為單因素設(shè)計(jì)，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，有可能優(yōu)化誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基。

組培苗的移栽成活率的高低決定組培技術(shù)成功與否。戴小英等[16]研究表明，黃樟組培苗在常規(guī)環(huán)境中煉苗3～5 天，可進(jìn)行移栽；移栽前用百菌清可濕性粉劑800～1 000 倍液浸沾后瀝干，以泥炭土和珍珠巖混合基質(zhì)為栽培基質(zhì)；移栽后適當(dāng)遮光、覆膜，可使黃樟組培苗成活率和新葉率達(dá)85%以上。本研究表明，檸檬醛型黃樟組培生根苗在透光率25% ～ 30%、溫度25 ～ 30 ℃的大棚內(nèi)煉苗7 ～ 10天，可移出瓶外，移栽20天內(nèi)適當(dāng)遮光，用塑料薄膜拱棚保持空氣濕度90%以上，移栽成活率可達(dá)91.33%。溫度、濕度、光照和栽培基質(zhì)是影響組培苗移栽成活率的關(guān)鍵因子，不同苗期對(duì)環(huán)境因子的要求不同，環(huán)境因子對(duì)組培苗煉苗和移栽的影響需進(jìn)一步研究。