不對稱二甲基精氨酸與新生兒持續性肺動脈高壓病理進程的相關性研究

張雯婷 陸琴 丁潔珺 顧猛

（1.南通大學附屬常州兒童醫院兒科實驗室，江蘇常州 213003；2.常州市氣管炎研究所藥學研究室，江蘇常州 213003；3.南通大學附屬常州兒童醫院新生兒科，江蘇常州 213003）

新生兒持續性肺動脈高壓（persistent pulmonary hypertension of the newborn，PPHN）是指出生后由于胎兒循環向成人型循環過渡失敗從而產生的以肺血管阻力持續增高、肺動脈壓高于體循環動脈壓、嚴重低氧血癥和中心性發紺為臨床特征的病理狀態［1］。每1 000例活產兒中有2例發生PPHN，其病死率高達4%～33%［2］。PPHN的病因和病理進程尚不完全明確，亟待探索［3］。

內源性一氧化氮（nitric oxide，NO）是血管內皮釋放的具有舒張血管活性的物質，它在胎兒出生后循環過渡的過程中發揮著重要作用：NO由內皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）響應肺部血流壓力和血氧的變化而產生，從而發揮一系列生物學作用，包括舒張肺部血管、緩解肺部炎癥和促進肺泡發育等［4］。不對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一種內源性的eNOS抑制劑和血管內皮風險因子，它競爭性地與L-精氨酸（eNOS的結合位點）結合從而減少NO的釋放，引起血管舒張障礙和一系列心、肺血管并發癥［5-6］。ADMA還通過增加氧化應激壓力、調節趨化因子信號通路和炎癥因子-炎癥相關受體交互作用等方式引起血管內皮功能和血管舒張障礙［7-8］。盡管ADMA的下游生物學效應包括血管抵抗和舒張血管障礙等都與PPHN病理進程密切相關，但其在PPHN中的角色極少被探索。

在本研究中，我們擬探討ADMA作為潛在PPHN疾病標志物和藥物治療靶標的可能性。為此，我們采用柱前衍生化-高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）檢測了30例PPHN和20例非PPHN足月新生兒出生后2周之內血清中的L-精氨酸、ADMA及其不被酶解代謝的同分異構體對稱二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine，SDMA）的濃度，以此探究ADMA在PPHN足月新生兒循環系統中的變化情況，為進一步明確ADMA在PPHN進程中的角色和后續開展對應的PPHN藥學防治研究提供詳實數據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2018年2月至2019年12月在常州市兒童醫院新生兒科確診PPHN的患兒30例為研究對象，納入標準：（1）符合PPHN診斷標準；（2）胎齡≥37周且＜42周；（3）入組時出生日齡＜3 d。PPHN患兒中20例合并有不同程度的肺炎，9例合并胎糞吸入綜合征，1例合并缺氧缺血性腦病和重度窒息。另選取胎齡和日齡與PPHN患兒匹配的在新生兒科接受治療或觀察的非PPHN新生兒20例為對照組，其中16例為新生兒肺炎，2例為面部挫傷伴輕度肺炎，2例為唇腭裂。PPHN的診斷符合中華醫學會兒科學分會制定的《新生兒肺動脈高壓診治專家共識》的診斷標準［9］。排除標準：排除包括房間隔缺損、室間隔缺損等先天性異常，多器官功能衰竭，肝酶升高及堿性磷酸酶異常等對甲基化精氨酸水平有影響的疾病。本研究經常州市兒童醫院倫理委員會審查批準（2017-014），并在樣本采集前獲得患兒家長知情同意。

1.2 血清樣本采集

采集兩組患兒入組第1、7、14天的全血樣本后，立即以3 500 r/min離心10 min，留取上清液于-80℃冰箱儲存待測。

1.3 血清中L-精氨酸及其甲基化代謝物的HPLCMS/MS檢測

樣品前處理：室溫解凍后的血清樣本以1∶3（v/v）的比例用超純水稀釋，加入內標高精氨酸溶液（500μmol/L），加入乙腈作為蛋白沉淀劑后以15 000 r/min離心10 min。取上清液于80℃水浴中空氣吹干，以4∶1（v/v）的比例加入鹽酸正丁醇（1 mol/L）作為柱前衍生化試劑，65℃水浴溫孵15 min。揮干鹽酸正丁醇，加入100μL超純水復溶樣品，11 500 r/min離心10 min后取上清再次離心，最后取上清5μL進樣。

色譜條件：5.0μm ODS C18色譜柱（島津，日本），柱溫：40℃；流動相A/B：甲醇/醋酸銨水溶液（10 mmol/L，pH4.0）。采用梯度洗脫，條件設定為：0～3 min，18%A；3～3.1 min，18%A轉換到60%A；3.1～5.5 min，60%A；5.5～5.6 min，60%A轉換到18%A。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；電離電壓：4.5 kV；毛細管溫度：380℃；霧化氣和氣簾氣：氮氣30 L/min；輔助氣：氮氣10 L/min；掃描方式：正離子掃描；監測模式：SRM。母離子/子離子對的選擇：L-精氨酸，231/70，20 eV；ADMA，259/214，20 eV；SDMA，259/228，20 eV；內標，245/84，15 eV。

1.4 統計學分析

用GraphPad Prism 6.0進行數據分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗；兩組不同時間點測定數據的變化值使用混合效應模型進行比較。非正態分布計量資料以中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料用百分率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PPHN組與對照組一般資料

兩組在胎齡、性別、出生體重、出生方式、胎糞吸入發生率和入組年齡方面比較差異無統計學意義（P＞0.05），但PPHN組的5 min Apgar評分顯著低于對照組（P＜0.05），窒息發生率顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較

30例PPHN組患兒中有13例接受吸入NO治療，給藥方案為初始劑量20 ppm，氧合穩定后逐漸降至5～6 ppm維持；23例使用米力農，給藥方案為先給予負荷劑量50～75μg/kg，靜脈滴注30～60 min后給予維持劑量0.50～0.75μg/(kg·min)；8例使用西地那非，給藥方案為鼻飼管每次注入西地那非0.5～1.0 mg/kg，每6 h給藥1次。其中，聯合使用吸入NO和米力農治療共7例，聯合使用米力農和西地那非治療共5例，聯合使用吸入NO、米力農和西地那非治療1例。

2.2 兩組不同時間血清精氨酸甲基化代謝物水平變化

在對照組和PPHN組新生兒血清中，ADMA的濃度在入組兩周內持續上升（P＜0.05），但上升過程有所區別：在入組第7天，PPHN組血清ADMA水平顯著高于對照組（P＜0.05）；但在第1天和第14天兩組ADMA水平差異無統計學意義（P＞0.05）。提示PPHN病理狀態可能與ADMA在循環系統中的濃度上升過程提前有關。

與ADMA的變化趨勢相反，在對照組和PPHN組新生兒血清中，其同分異構體SDMA的濃度出現持續下降，從而造成ADMA/SDMA比值上升（P＜0.05）。PPHN組和對照組的SDMA水平、ADMA/SDMA比值在各時間點差異均無統計學意義（P＞0.05）。

血清L-精氨酸在兩組中出現溫和上升的趨勢，入組第14天時，PPHN組和對照組的L-精氨酸水平均顯著高于同組第1天的水平（P＜0.05）。PPHN組與對照組的L-精氨酸水平在各時間點差異均無統計學意義（P＞0.05）。

在PPHN組中，NO利用率的替代指標L-精氨酸/ADMA比值在入組第7天和第14天均顯著低于入組第1天（P＜0.05），而對照組的L-精氨酸/ADMA并未隨時間出現顯著波動（P＞0.05）。見表2。

表2 入組第1、7、14天血清精氨酸甲基化代謝物水平比較 （±s）

表2 入組第1、7、14天血清精氨酸甲基化代謝物水平比較 （±s）

注：［ADMA］不對稱二甲基精氨酸；［SDMA］對稱二甲基精氨酸。a示與同組第1天比較，P＜0.05；b示與同組第7天比較，P＜0.05。對照組：第1天n=20；第7天n=14；第14天n=8。PPHN組：第1天n=30；第7天n=28；第14天n=26。

第14天0.70±0.20 0.82±0.24a 11.483 0.509 ADMA(μmol/L)組別對照組PPHN組F值P值SDMA(μmol/L)第1天0.73±0.19 0.69±0.27 47.674 0.867第7天0.79±0.10 0.99±0.26a 35.695 0.004第14天1.04±0.15a,b 1.17±0.39a 26.766 0.470第1天1.05±0.19 1.02±0.23 46.077 0.914第7天0.86±0.26a 0.82±0.22a 20.288 0.970 L-精氨酸(μmol/L)第1天44±14 39±11 32.860 0.465第7天48±8 42±12 34.407 0.194第14天57±12a 51±13a,b 10.005 0.601組別對照組PPHN組F值P值ADMA/SDMA L-精氨酸/ADMA第1天0.71±0.21 0.69±0.22 42.636 0.986第14天1.56±0.31a 1.44±0.29a,b 9.045 0.790第7天0.99±0.33a 1.22±0.27a 20.345 0.144第14天56±13 46±12a 9.225 0.291第1天62±25 62±23 39.184 0.999第7天61±8 43±10a 28.832＜0.001

2.3 不同預后PPHN患兒血清精氨酸甲基化代謝物及其他實驗室指標的水平變化

入組7 d后，經治療，30例入組的PPHN患兒中有18例肺動脈收縮壓（systolic pulmonary arterial pressure，sPAP）低于35 mm Hg；檢測分析28例患兒血樣（2例患兒血樣因出現溶血未被采用），發現與經7 d治療后sPAP≤35 mm Hg的PPHN患兒相比，經7 d治療后sPAP＞35 mm Hg的PPHN患兒存在顯著的動脈氧分壓和動脈氧分壓/吸入氧濃度比值降低，血清中ADMA和L-精氨酸的含量出現顯著的上升（P＜0.05），見表3。

表3 入組7 d后不同預后PPHN患兒實驗室檢測指標比較 （±s）

表3 入組7 d后不同預后PPHN患兒實驗室檢測指標比較 （±s）

注：［PaO2］動脈氧分壓；［PFR］動脈氧分壓/吸入氧濃度；［sPAP］肺動脈收縮壓；［ADMA］不對稱二甲基精氨酸；［SDMA］對稱二甲基精氨酸。*示全部18例sPAP≤35 mm Hg的PPHN患兒中，2例患兒血樣出現溶血未被采用，所得數據對應的實際例數為16例。

n 組別sPAP≤35 mm Hg sPAP＞35 mm Hg t值P值PFR(mm Hg)356±105 156±59 5.969＜0.001 sPAP(mm Hg)25±3 43±9 7.910＜0.001 ADMA(μmol/L)0.89±0.25*1.14±0.20 2.896 0.007 SDMA(μmol/L)0.77±0.19*0.91±0.24 1.780 0.086 18 12 PaO2(mm Hg)109±22 71±16 5.139＜0.001 L-精氨酸(μmol/L)37±12*49±9 3.000 0.006 L-精氨酸/ADMA 42±10*44±10 0.577 0.569 ADMA/SDMA 1.17±0.20*1.31±0.33 1.451 0.158

3 討論

PPHN是一種致死性和致殘率均較高的疾病，其原發或繼發于非肺部疾病，導致新生兒出現嚴重的低氧血癥和中心性發紺。大量的研究表明NO缺乏和內皮功能障礙對PPHN病理進程有著關鍵影響［10-11］。NO吸入是美國食品藥品監督管理局批準的用于治療PPHN、舒張肺血管的重要治療方案，但是在新生兒中經常出現治療效果不理想［12］。多中心隨機對照試驗證實吸入性NO治療雖然可以有效改善50%PPHN患兒的氧合情況，并顯著減少體外膜肺氧合的使用率，但對致死率和致殘率沒有顯著改善［13］；甚至有研究表明，繼發于膈疝的PPHN在實施吸入性NO治療后會造成更差的后果［13］。因此，尋找新的藥學線索和治療方案是目前PPHN治療中的熱點研究領域。

ADMA是蛋白質結合的精氨酸在精氨酸甲基轉移 酶（protein-arginine methyltransferases，PRMT）的作用下被二甲基化繼而水解得到的氨基酸。ADMA通過競爭性抑制NOS的活性減少NO的產生和NO非依賴的兩類方式發揮多效的生物學效應，造成肺血管抵抗，增加肺血管壓力。在本研究中，我們發現PPHN病理進程可能與ADMA的自然上升過程提前有關，表現為PPHN組新生兒血清ADMA在入組第7天顯著高于對照組，而在第1天和第14天沒有顯著差異。此外，本研究中還發現較高的ADMA水平與PPHN的治療響應不佳有關，表現為治療7 d后，sPAP仍然高于35 mm Hg的PPHN患兒血清ADMA濃度顯著高于肺動脈壓力控制理想的患兒。因此，本研究提示ADMA參與足月兒肺動脈高壓的病理進程，且有可能是潛在的藥物治療靶標。

體內多于80%的ADMA由二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）進行代謝，因此DDAH的表達和活性是ADMA水平的決定因素之一［14］。SDMA是ADMA的同分異構體，亦由PRMT催化前體L-精氨酸而產生，但其不被DDAH代謝，而是以原型從尿液排出。因此，ADMA/SDMA比值常被用作DDAH活性的替代指標［15］。本研究發現足月兒出生后兩周內ADMA水平逐步上升，SDMA則持續下降，同時ADMA/SDMA比值持續上升，這一現象同時發生在PPHN組和對照組中，表明在足月兒出生后兩周內DDAH的表達和活性可能存在以下降為總體趨勢和特征的發育過程。有研究表明，新生豬體內DDAH2的表達和活性在出生后保持上調，在1日齡達到頂峰，此后保持持續下降，直至成年，這一發現與我們的臨床結果吻合［16］。

在低壓缺氧條件誘導出的PPHN豬模型的肺組織中，DDAH2的表達和總DDAH活性顯著低于正常豬，表明DDAH的表達或活性異常與PPHN形成有關［16］。在本研究中，入組第7天，PPHN組血清ADMA和ADMA/SDMA的不同程度增高提示PPHN病理條件下ADMA在循環系統中的累積與DDAH活性降低有關，結合高ADMA水平與治療響應不佳的發生有關，多角度表明ADMA/DDAH通路是PPHN病理進程的重要參與者。

此外，線粒體氧化應激壓力增加和由此造成的氧化應激敏感的信號通路的變化對包括PPHN在內的多種心肺疾病的發生起著直接的致病作用［17-18］。ADMA在造成eNOS解偶聯的過程中，不僅引起NO的釋放減少，還會產生大量的超氧自由基，從而造成氧化-還原平衡的失調。一方面，氧化應激在肺血管重塑和肺血管內皮功能障礙的過程中扮演核心作用，從而增加肺動脈高壓的發生和嚴重程度［19］；另一方面，DDAH對氧化還原狀態極為敏感，其發揮催化活性的關鍵位點Cys-249位上的-SH基團易被氧化失活，從而造成ADMA的降解減少并進一步造成氧化應激加重，形成惡性循環，放大ADMA對內皮和心血管的毒性效應［20］。因此，有研究認為ADMA是包括肺動脈高壓在內的多種心血管疾病的獨立風險因子，而調節ADMA水平可能產生獨立于調節NO之外的其他益處［21］。臨床前研究表明，具備ADMA拮抗能力的他汀類藥物在實驗動物中表現出了抗肺動脈高壓的保護作用［22］。此外，產前給予辛伐他汀能夠預防硝基芬誘導的先天性膈疝動物模型中出現肺血管重塑和PPHN［23］。結合本研究結果，我們認為ADMA造成心肺損害的機制與其促氧化應激的機制有關，抑制ADMA生物學功能是極具潛力的PPHN治療新思路。

綜上所述，足月兒PPHN病理進程可能與其循環系統中ADMA上升過程提前有關；血清ADMA水平的升高與PPHN治療抵抗有關。因此，調節ADMA及其代謝酶DDAH的活性可能是未來提高PPHN治療響應，甚至預防PPHN發病的潛在藥學干預策略研發思路。