基于TCGA數據庫分析JMJD6在肝癌組織中的表達及臨床意義

趙冉，武燕潔，劉振鳳，馮圣鋆，蘭蓓

（天津醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，天津 300070）

肝癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，因此對肝癌中異常表達基因的研究將有助于尋找新的治療靶點。JMJD6蛋白屬于Jumonji C domain-contai ning（JMJD）蛋白家族，主要定位在細胞核內，具有催化組蛋白或非組蛋白賴氨酸羥基化和精氨酸去甲基化活性。最新研究發現，JMJD6還具有酪氨酸激酶活性[1]。JMJD6在多種生物學過程中發揮重要作用，能夠將組蛋白H4R3me2去甲基化[2]，并通過與Br d4結合調控轉錄[3]。JMJD6能夠與剪接因子U2AF65結合并羥基化其第15位和第276位賴氨酸，進而影響RNA剪接[4]。此外，JMJD6能夠磷酸化組蛋白H2A.X第39位酪氨酸，促進細胞自噬[1]。同時，越來越多的研究表明，JMJD6在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、膠質母細胞瘤、黑色素瘤等多種癌癥中發揮作用[5-9]，但是其在肝癌中的作用仍有待進一步研究。為了探討JMJD6在肝癌中的作用，筆者對TCGA數據庫進行數據挖掘，分析JMJD6在肝癌組織中的表達水平及其與預后的關系，并進一步分析JMJD6表達對細胞信號通路的影響，為其作為肝癌診斷和治療的靶點奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據資料收集及患者分組從GDC（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載TCGA肝癌患者項目為TCGALIHC的RNA FPKM數據和患者臨床資料。剔除缺少RNA數據或臨床信息的患者，且相同患者保留原位癌數據，最后371例肝癌患者列入本次分析（其中50例患者包括癌組織和正常組織，其余321例僅包括癌組織）。以肝癌組織中JMJD6 mRNA表達量中位值為界（MEDIA=3.380），將患者分為高表達組（185例）和低表達組（186例）。JMJD6在正常組織和肝癌組織中的免疫組化數據來自The Human Protein Atlas（HPA：https：//www.proteinatlas.org/）。

1.2 JMJD6表達的差異分析及與患者臨床特征的關系比較肝癌患者正常組織和腫瘤組織中的JMJD6表達量差異，以及不同臨床分期或病理分級患者之間的表達差異，尋找JMJD6表達與臨床特征的相關性。進行Kaplan-Meier生存分析及Cox回歸分析，探討JMJD6表達與肝癌患者預后的關系。其中Kaplan-Meier生存分析刪除了1例無生存數據病例，Cox回歸分析中刪除27例臨床信息不全的病例。

1.3 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）利用GSEA 4.0.1對腫瘤樣本JMJD6高表達組和低表達組的差異表達基因進行比較分析，探討JMJD6表達水平對細胞信號通路的影響?；蚣瘮祿爝x擇kegg.v7.4，置換次數設定為1 000次，以q<0.05為顯著富集基因集。

1.4 統計學處理數據用R語言R-4.0.3進行整理和統計學分析。非正態分布的計量數據采用中位數（P25，P75）描述，進行Wilcoxon檢驗比較JMJD6表達差異，進行單因素Logistic回歸分析JMJD6表達量與臨床特征的相關性。繪制Kaplan-Meier生存分析曲線，進行單因素和多因素Cox回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 JMJD6在肝癌組織中的表達腫瘤組織中JMJD6 mRNA表達顯著升高[腫瘤組織：3.380（2.489，4.969），正常組織：1.606（1.283，2.322），W=2 506，P＜0.001，圖1A]。此外，將50個正常組織及其對應的腫瘤組織進行配對分析，結果同樣顯示，腫瘤組織中JMJD6表達高于正常組織（配對樣本Wilcoxon檢驗，W=87，P＜0.001，圖1B）。在HPA數據庫中，JMJD6免疫組化染色結果也證明了其在肝癌組織中高表達（圖1C）。

圖1 JMJD6在正常組織和肝癌組織中的表達情況Fig 1 The expression of JMJD6 in normal tissues and HCC tissues

2.2 JMJD6表達與臨床特征之間的關系應用患者的臨床數據分析JMJD6與臨床分期及病理分級的關系。結果顯示，與stageⅠ期患者相比，stageⅡ、Ⅲ期患者JMJD6表達水平升高，且差異具有統計學意義[stageⅠ：3.093（2.341，4.060），stageⅡ：3.845（2.979，6.220），stageⅢ：4.112（2.526，5.640），stageⅡvs.stageⅠ：W=5 041，P<0.001，stageⅢvs.stageⅠ，W=5 543，P<0.01，圖2A]。同樣，與G1級相比，G3、G4級患者JMJD6表達水平也升高[G1：2.844（2.012，4.237），G2：3.089（2.415，4.373），G3：3.987（3.050，6.105），G4：4.386（3.433，5.355），G3 vs.G1：W=2 140，P<0.001，G4 vs.G1：W=185，P<0.05，圖2B]。采用單因素Logistic回歸分析JMJD6表達與不同臨床病理特征之間的關系，JMJD6高表達與病理分級和臨床分期呈正相關，與年齡呈負相關，而與性別無關（表1）。

表1 JMJD6基因表達水平與肝癌患者臨床特征的關系Tab 1 Relationship between JMJD6 gene expression level and clinical indicators in patients with HCC

圖2 JMJD6 mRNA表達量與臨床分期、病理分級的關系Fig 2 The relationship between the expression of JMJD6 mRNA and clinical stage/pathological grade

2.3 JMJD6表達與肝癌預后的關系為了研究JMJD6表達與腫瘤患者生存率之間的關系，進行Kaplan-Meier生存分析。結果顯示，JMJD6高表達患者中位生存期為4.082年，少于低表達患者的5.838年（χ2=5.541，P<0.05，圖3A）。Kaplan-Meier Plotter在線數據庫顯示，JMJD6高表達患者和低表達患者的中位生存期分別為41個月和81.9個月（P<0.001，圖3B）。

圖3 JMJD6 mRNA表達量對肝癌患者生存率的影響Fig 3 The effect of JMJD6 mRNA expression on survival rate of patients of HCC

采用單因素Cox回歸分析年齡、性別、病理分級、臨床分期、飲酒、Hepatitis B或Hepatitis C感染與否、吸煙及JMJD6表達量對肝癌患者預后的影響。結果顯示，臨床分期、Hepatitis C感染和JMJD6表達量與肝癌患者預后相關。進一步將單因素分析有統計學意義的變量納入多因素回歸分析中，與臨床分期stageⅠ患者相比，stageⅢ和Ⅳ患者死亡風險升高（HR=2.292，95%CI：1.469~3.575，P＜0.001；HR=8.202，95%CI：2.484~27.079，P＜0.001）；丙型肝炎病毒感染及JMJD6高表達患者死亡風險也升高（HR=2.115，95%CI：1.426~3.139，P＜0.001；HR=1.109，95%CI：1.039~1.184，P＜0.01），見表2。

表2 肝癌患者總生存率的單因素和多因素Cox回歸分析Tab 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of overall survival rate in patients with HCC

2.4 JMJD6表達水平對細胞信號通路的影響通過GSEA分析，探討JMJD6表達所影響的信號通路。JMJD6高表達組中，前5個富集的基因集包括：核糖體、剪接、DNA復制、細胞周期。JMJD6低表達組中，前10個富集的基因集包括：脂肪酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、色氨酸代謝等（圖4）。

圖4 GSEA分析JMJD6表達對細胞信號通路的影響Fig 4 GSEA analysis of the effect of JMJD6 expression on cell signaling pathway

3 討論

肝癌是常見的癌癥類型之一，其發生與多種因素有關，其中以慢性乙型肝炎病毒感染和肝硬化最為常見。肝癌的治療方法包括肝移植、肝切除、消融、化療栓塞，靶向治療肝癌的一線藥物包括索拉非尼等，但是肝癌的治療效果仍然不令人滿意[10]。因此，發現肝癌組織中異常表達的蛋白并確定其作用機制，將為肝癌的診療提供新的作用靶點。

JMJD6能夠催化賴氨酸羥基化和精氨酸去甲基化，其底物包括組蛋白和多種非組蛋白。越來越多的研究發現，JMJD6在多種癌癥中異常表達，促進腫瘤的生長、轉移。其機制包括：在結腸癌中，JMJD6結合并羥基化p53的K382，抑制了p53的轉錄活性[11]；在乳腺癌中，JMJD6能夠抑制轉化生長因子-β通路[5]，且JMJD6在雌激素受體α結合的增強子的募集是RNA聚合酶Ⅱ招募和增強子RNA產生所必需的，因此雌二醇引起的乳腺癌細胞增殖依賴于JMJD6[12]。

在本研究中，筆者利用TCGA數據庫，發現在肝癌患者的癌癥組織中JMJD6 mRNA表達量高于正常組織，且隨著癌癥患者分期增加或者病理分級增加，JMJD6表達也升高。其中，stageⅣ患者與stageⅠ患者相比，JMJD6表達無明顯差別（P>0.05），原因可能在于stageⅣ僅為5例，樣本量過小，不具有代表性。單因素Logistic回歸分析顯示JMJD6高表達與年齡、臨床分期和病理分級相關。以上結果說明JMJD6 mRNA高表達與肝癌的發生、發展相關。其次，Kaplan-Meier生存曲線結果表明，JMJD6 mRNA高表達導致肝癌患者生存率下降，Cox回歸分析顯示JMJD6表達量、臨床分期及丙型肝炎病毒感染是患者預后的獨立危險因素，即JMJD6高表達導致了肝癌患者的不良預后。

GSEA分析結果顯示，JMJD6高表達組在RNA剪接、DNA復制、細胞周期等通路富集。RNA剪接是JMJD6已知重要功能之一，在黑色素瘤中，JMJD6通過影響p21-Activated kinase 1（PAK1）的可變剪接，激活絲裂原活化蛋白激酶通路，促進腫瘤細胞生長、侵襲[8]；細胞周期的失調是腫瘤細胞異常增殖的基礎[13]，JMJD6高表達伴隨細胞周期通路基因的富集，如Cyclin B1（CCNB1）、Cyclin B1（CCNB2）、細胞周期蛋白依賴激酶2（CDK2）的高表達，與腫瘤的發生緊密相關[14]。此外，JMJD6高表達組在DNA復制通路富集，包括在DNA復制過程中起關鍵作用的MCM蛋白。而根據之前的報道，MCM家族蛋白能夠促進肝癌的增殖[15]。JMJD6低表達組在脂肪酸和氨基酸代謝通路富集，而JMJD6在腫瘤代謝中的研究還未見報道，該結果提示JMJD6在代謝過程可能也發揮作用。

筆者還分析了JMJD6在肝癌患者中的突變和拷貝數改變的情況（結果未展示）。在已知信息的364例患者中，僅有1例患者JMJD6基因發生突變，說明JMJD6在肝癌患者中的突變頻率很低。JMJD6不屬于拷貝數顯著擴增或缺失基因，因此JMJD6突變及拷貝數變化不是導致其在腫瘤中表達升高的原因。

總之，本研究結果說明JMJD6在肝癌組織中高表達，與肝癌的發生、發展及患者不良預后相關，為后續研究鑒定了基礎。