鹽酸右美托咪定對膿毒癥急性肺損傷小鼠基質金屬蛋白酶7抑制作用研究

齊穎，陳兵

（天津醫科大學第二醫院ICU，天津 300211）

膿毒癥是重癥醫學科常見病，病死率較高且預后差，臨床常見的感染源是肺部感染，此外有腹腔感染及泌尿系統等感染。膿毒癥常累及呼吸系統，在機械通氣患者中治療效果欠佳，存在院內感染的高風險，適度的鎮靜、鎮痛可有效緩解患者痛苦及焦慮，該類患者病情進展迅速常合并急性肺損傷（acute lung injury，ALI）甚至急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），即使康復后部分患者也可能出現肺組織纖維化，嚴重影響生活質量。基質金屬蛋白酶（MMP）7是Wnt/β連環蛋白的靶基因產物，在膿毒癥致ALI/ARDS的早期激活，它可破壞肺組織的正常結構，在部分病例中引起肺纖維化[1]。右美托咪定是ICU常用的鎮靜藥物，該藥對患者呼吸抑制作用弱、無蘇醒延遲，恰當應用該藥物能減少患者機械通氣時間及呼吸機相關性肺炎發生率，該藥產生的鎮靜、鎮痛及抗炎作用能減輕肺水腫程度[2]。其治療機制可能是通過抗氧化應激、改善巨噬細胞聚集從而抑制炎癥因子的釋放，起到臟器保護的作用。MMP7在肺損傷早期升高，具有一定程度致纖維化的作用，通過研究該酶在急性肺損傷小鼠的表達水平來進行早期肺損傷的診斷[3]。本研究建立膿毒癥致小鼠ALI模型，通過光鏡和電鏡下觀察肺組織病理改變及檢測不同時間點血清MMP7濃度變化，研究右美托咪定對急性肺損傷小鼠的肺保護作用。

1 材料及方法

1.1 材料實驗動物為雄性昆明小鼠，體重20~25g。大腸桿菌脂多糖購自Sigma（血清型055：B5），鹽酸右美托咪定注射液（2 ml：0.2 mg）購自揚子江藥業集團有限公司，部分試劑由天津醫科大學第二醫院心臟研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將96只小鼠隨機分為3組，分別為對照組、ALI組、治療組，每組32只；每組各分為1、3、5、8 h 4個不同的損傷時間點。ALI組及治療組腹腔注射脂多糖10 mg/kg。對照組注射等劑量生理鹽水，治療組在脂多糖注射結束后半小時經腹腔注射右美托咪定25μg/kg。小鼠在注射脂多糖40 min左右出現嗜睡、寒戰、呼吸頻率增快、進食及飲水減少，部分小鼠并出現腹瀉等表現。光鏡下觀察病理改變，ALI組肺組織肺泡間隔增厚，血細胞及炎性細胞滲出到肺泡腔內，表示造模成功。

1.2.2 標本收集及處理 到達相應的處理時間點，將小鼠麻醉完全后從內眥取血低溫3 000 r/min離心15 min保留上清至-20℃冰箱備用。右肺下葉組織浸泡在10%福爾馬林，保存至4℃冰箱，光鏡下觀察組織病理改變。右肺中上葉進行肺組織勻漿提取蛋白質。左肺組織保存在2.5%戊二醛進行電子染色，在透射電鏡下觀察肺血管內皮的變化。

1.2.3 Western印跡檢測 小鼠肺組織勻漿提取蛋白樣本保存于-80℃。提取的蛋白質按照試劑盒進行操作：（1）取20μg/孔蛋白質進行10%SDS-PAGE。（2）配膠上樣（上層膠5%，下層膠10%）。電泳（上層膠60 V，下層膠120 V）。（3）切所需部分放入1×轉膜緩沖液。將PVDF膜也放入轉膜緩沖液。（4）取出PVDF膜做標記后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。（5）一抗（MMP-7 1：1 000優寧維，β-actin 1：10 000）4℃孵育過夜。（6）1×TBST洗15 min，重復3次。（7）二抗（1：4 000聯科）室溫孵育2 h。（8）1×TBST洗15 min×3次。（9）暗室顯影：壓片、曝光、顯影、定影。（10）分析結果。

1.2.4 血清MMP-7濃度的測定 采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分別測定損傷1、3、5、8 h血清MMP-7濃度，嚴格參照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學處理數據由SPSS21.0及Graphpad prism7、ImageJ軟件進行分析及作圖。正態分布計量資料以±s表示。組間數據比較采用單因素方差分析，P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理改變對照組肺組織結構清晰，肺泡壁無增厚，肺泡腔無液體及血細胞滲出，隨著損傷時間的延長，損傷組肺組織的結構逐漸破壞加重，肺泡壁增厚明顯，肺泡皺縮，肺泡腔內血細胞滲出，炎性細胞滲出，到損傷5 h時，肺泡的結構幾乎塌陷，炎性細胞浸潤，甚至形成透明膜。與同時間點損傷組相比較，治療組肺組織炎癥緩解，炎性細胞滲出減少，肺組織病變程度減輕（圖1）。

圖1 3組小鼠在不同時間點肺組織病理結構的改變Fig 1 Changes of pathological structure of lung tissue in three groups of mice at different time

2.2 不同時間點測定小鼠血清MMP7濃度治療組血清MMP-7濃度較同時間點ALI組降低（P＜0.01）（表1）。

表1 各組不同時間點血清MMP7濃度（pg/mL）Tab 1 Serum MMP7 concentration at different time in each group（pg/mL）

2.3 電鏡下觀察肺血管內皮細胞的改變電鏡下肺損傷3 h時血管內皮損傷的變化，對照組肺組織血管內皮細胞基質內空泡較少，無細胞的腫脹，基膜相對完整（圖2A）。ALI組細胞基質內出現空泡，基膜完整性被破壞（圖2B）。治療組內皮基膜的病變程度較損傷組有所減輕（圖2C）。

圖2 電鏡下肺血管內皮細胞的改變（放大倍數10 000×）Fig 2 Changes of pulmonary vascular endothelial cells under electron microscope（magnification power 10 000×）

2.4 Western印跡檢測在損傷3 h時，與對照組相比，ALI組MMP-7的表達水平較高，治療組MMP-7表達下降（P＜0.01）（圖3）。

圖3 Western印跡檢測3組MMP-7蛋白的表達Fig 3 The expression of MMP-7 protein in three groups by Western blotting

3 討論

膿毒癥急性肺損傷（ALI/ARDS）是ICU的常見危重病，感染、創傷、缺血再灌注、胃內容物吸入呼吸道均可引起肺損傷的發生，引起膿毒癥的感染源具有多樣性，臨床以肺部感染為主，其次為腹腔感染及泌尿系感染等。出現ARDS時預后極差，并且給患者帶來較高的治療費用[4]。

膿毒癥肺損傷發病機制較復雜，通過制備動物模型可再現損傷過程的病理機制，微血管內皮結構及功能的變化在急性肺損傷早期起核心作用，免疫系統會釋放大量促炎和抗炎細胞因子，如IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α等因子，循環中高水平的細胞因子可增強對組織器官的損害，內皮屏障破壞后富含蛋白質的液體滲出增加，部分大分子物質也會進入組織間隙和肺泡間隙從而引起肺水腫，有研究表明內皮損傷與中性粒細胞活化有關[5]；此外，內皮細胞能產生內皮素-1、血管緊張素-2及前列環素，它們可調節血管舒張及收縮功能，在肺損傷過程中起到重要作用。通過抑制炎癥因子釋放、免疫調節治療可產生臟器保護作用[6]。

右美托咪定是ICU常用的鎮靜劑，臨床應用中對患者的呼吸抑制作用較少，因此也常應用于圍術期鎮靜，適當的鎮靜、鎮痛不僅能使患者克服恐懼心理，還能減少呼吸機的使用時間，改善患者預后[7]。右美托咪定作用于藍斑核，有較高的蛋白結合率，容易穿過血-腦屏障，通過激活中樞神經系統和外周脊髓的α2腎上腺素能受體而產生鎮靜和鎮痛及抗交感作用，可抑制氧化作用及抑制細胞凋亡。研究表明它能一定程度緩解膿毒癥肺損傷的炎性反應。其機制可能是通過抑制核因子-κB（NF-κB）活化，減輕TNF-α等炎癥因子的釋放[8]，減輕肺臟炎癥滲出的程度，延長小鼠的生存時間。應用右美托咪定的抗炎機制可能是通過Toll樣受體4（TLR4）起作用，也有學者研究發現右美托咪定可改善線粒體功能從而抑制神經細胞凋亡[11]，可能和改善線粒體通透性相關，該藥物能抑制下游炎癥細胞因子的產生，對臟器產生保護作用，也能降低心肌缺血的并發癥[12]。

MMP是含鋅的內肽酶家族。目前已研究出的有23種不同的MMP，這些酶作為無活性的前體形式進行分泌，需要激活才能形成有功能性活性酶[9]。有學者研究發現在健康組織中，MMP活性常較低，在病理情況下如炎癥、肺纖維化時該酶會升高。在一項比格犬特發性肺纖維化的實驗研究中[10]，研究者發現MMP高表達，能破壞細胞間的機制及細胞間的連接，其作用可導致早期的肺纖維化，給臨床治療帶來極大的困難，因此預防早期肺臟的纖維化有很必要的作用。通過測定循環中MMP7的表達可早期識別肺損傷并且進行早期干預[13]，早期觀察到血管內皮損傷，采取恰當的治療措施改善患者預后。MMPs的過度表達導致肺組織損傷和重塑，如果能抑制MMPs表達則可能作為治療ALI/ARDS的一種新的潛在方法[14]。右美托咪定能一定程度抑制MMP7的表達，但具體機制尚需進一步的實驗證實[15]。

本實驗中，治療組小鼠血清MMP7表達降低，光鏡下觀察肺組織炎性滲出較對照組減少，電鏡觀察肺血管內皮細胞損傷程度減輕，表明在膿毒癥急性肺損傷早期給以右美托咪定治療后，能夠抑制炎性因子的釋放，減輕肺血管內皮損傷，有效抑制肺纖維化進展。

綜上所述，右美托咪定降低膿毒癥急性肺損傷MMP7表達，抑制炎性因子釋放，對血管內皮細胞起保護作用。對于膿毒癥急性肺損傷的治療具有一定指導意義。但右美托咪定抑制MMP7產生的機制尚不明確，動物實驗對于臨床治療的指導意義有待后續進一步探討。