類風濕關節炎患者血清14-3-3η蛋白水平及臨床檢測價值的初步研究

王偉遠，劉丹丹，張蓓，蔡悅，薄娜娜，雷潔，李會強

（1.天津醫科大學醫學檢驗學院，天津 300203;2.天津中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科，天津 300193；3.天津中醫藥大學第一附屬醫院風濕免疫科,天津 300193）

類風濕關節炎（R A）是臨床上常見的自身免疫性疾病，以雙側小關節慢性關節炎為特征，嚴重滑膜炎可損害關節功能及致殘[1]。類風濕因子（RF）和抗環瓜氨酸肽抗體（anti-CCP）是RA診斷和分型的傳統血清標志物，風濕科醫生根據這些生物標志物，結合關節癥狀和放射學證據，可以診斷RA并評估疾病的發展進程。然而RA臨床表現多樣，部分早期癥狀不典型的患者和（或）血清學陰性的患者常被誤診、漏診[2-3]。因此，臨床迫切需要發現更有價值的生物學標志物，以提高目前RA的診斷和疾病監測水平。有研究發現，14-3-3蛋白是一組高度保守的蛋白家族，由7種亞型（β、γ、ε、η、σ、θ和ζ）組成。Kilani等[4]發現，炎性關節疾病患者的關節液和血清中14-3-3蛋白的η和γ2個亞型顯著增高，進一步研究發現，血清14-3-3-η是一種新的特異性較高的RA生物標志物，其參與了RA相關炎癥介質表達的上調和關節損傷機制[5]。本研究通過測定血清14-3-3η、RF、D-二聚體（D-Dimer）、紅細胞沉降率（ESR）、anti-CCP、CRP水平，分析評估血清14-3-3η水平對RA患者的診斷價值，并探討該生物標志物與其他實驗室指標以及臨床指標的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象研究對象均為2020年5月—12月天津中醫藥大學第一附屬醫院門診及住院患者或健康體檢者。RA組136例，其中男28例，女108例，診斷符合1987年美國風濕病學會（ACR）及2010年歐洲抗風濕聯盟（EULAR）制定的RA分類標準，患者在確診前均未進行相關對癥藥物治療。疾病對照組65例，為非R A關節病變患者（系統性紅斑狼瘡18例，結締組織病17例，骨關節病22例，銀屑性關節炎4例，強直性脊柱炎4例），其中男12例，女53例。健康對照組36名，為體檢健康者，其中男22名，女14名。所有患者均符合相關指南診斷標準[2，6-7]，并經風濕免疫科醫生確認。所有標本均在患者知情同意條件下獲得，并獲得倫理委員會批準許可，審批號為TMUHMEC2017008。

1.2 相關實驗室指標檢測受試者于清晨采集空腹靜脈血分別置于真空采血管中，分離膠促凝血于3 500 r/min離心8 min，分離血清，離心半徑19 cm，用于14-3-3η、anti-CCP、CRP、RF的檢測。枸櫞酸鈉抗凝血于3 000 r/min離心15 min，離心半徑19 cm，分離血漿，用于檢測D-Dimer。枸櫞酸鈉抗凝全血用于ESR檢測。RF、CRP檢測所用儀器為西門子BNII蛋白分析儀及其配套試劑。采用光激化學發光法檢測14-3-3η蛋白，檢測儀器為LICA HT光激化學發光分析儀（試劑為國產光激化學發光試劑），采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測anti-CCP，檢測儀器為RAYTO RT-6100酶標分析儀（試劑為深圳亞輝龍試劑盒），根據試劑說明書，14-3-3η蛋白≥0.2 ng/mL為陽性，采用散射免疫比濁法檢測RF、CRP，檢測儀器為西門子BNII蛋白分析儀及其配套試劑。采用免疫比濁法檢測D-Dimer，檢測儀器為希森美康CX-5100凝血分析儀及其配套試劑，采用魏氏法（Westergren）檢測ESR，檢測儀器為亞輝龍VISON-C分析儀。

1.3 統計學處理采用統計學軟件SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0對數據進行統計學分析，定量變量用±s或中位數（P25，P75）表示，分類變量用頻數和百分比表示。兩組間比較采用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗。分析定量結果指標的相關性采用Spearman秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象臨床資料RA組平均年齡（56.2±12.7）歲。疾病對照組平均年齡（61.9±10.5）歲。健康對照組平均年齡（32.4±6.9）歲。各組間年齡、性別差異均無統計學意義（均P＞0.05），具有良好的可比性。

2.2 血清14-3-3η蛋白水平RA組血清14-3-3η蛋白水平為0.18（0.07，0.843）ng/mL，以cutoff≥0.2 ng/mL作為陽性區分標準，將RA組分為14-3-3η陰性組和14-3-3η陽性組，14-3-3η陽性組14-3-3η水平為0.86（0.45，2.31）ng/mL，14-3-3η陰性組為0.08（0.04，0.11）ng/mL（U=0.0，P＜0.000 1）。在疾病對照組中14-3-3η水平為0.07（0.05，0.09）ng/mL，在健康對照組中為0.02（0.02，0.03）ng/mL。RA組14-3-3η水平顯著高于疾病對照組和健康對照組（U=2 272.5、441.5，均P＜0.000 1）；同時在疾病對照組血清14-3-3η蛋白濃度也顯著高于健康對照組（U=237，P＜0.000 1），見圖1、2。

圖1 RA患者14-3-3η蛋白表達水平Fig 1 The expression of 14-3-3ηprotein in patients with RA

圖2 血清14-3-3η蛋白表達水平Fig 2 Expression of serum 14-3-3ηprotein

2.3 RA組14-3-3η水平與臨床指標相關性分析Spearman相關分析顯示，RA患者14-3-3η陽性組血清14-3-3η水平與RF、DAS28-CRP均呈正相關（均P＜0.05），與ESR、D-Dimer均呈負相關（均P＜0.05），與其他指標不相關，見表1。

表1 血清14-3-3η蛋白與各項臨床指標相關性分析Tab 1 Correlation between serum 14-3-3ηprotein and various clinical indicators

2.4 RA患者14-3-3η陽性組與陰性組相關指標表達差異分析RA患者14-3-3η陽性組RF與anti-CCP的表達均顯著高于14-3-3η陰性組（P=0.000、0.006），而其他指標沒有差異，見表2。

表2 14-3-3η陽性組與陰性組間各項臨床指標比較[±s，M(Q1，Q3)]Tab 2 Comparison of various clinical indicators between 14-3-3ηpositive group and negative group[±s，M(Q1，Q3)]

表2 14-3-3η陽性組與陰性組間各項臨床指標比較[±s，M(Q1，Q3)]Tab 2 Comparison of various clinical indicators between 14-3-3ηpositive group and negative group[±s，M(Q1，Q3)]

注：DAS28：28個關節疾病活動評分；TJC：壓痛關節數；SJC：腫脹關節數；CRP：C反應蛋白；RF：類風濕因子；ESR：紅細胞沉降率；anti-CCP：抗CCP抗體；D-Dimer：D二聚體

指標 14-3-3η陽性組（n=66） 14-3-3η陰性組（n=70） U P DAS28 6.06±1.18 5.82±1.17 1 957.5 0.205 DAS28-CRP 6.13（3.90，5.83） 5.17（4.34，5.84） 1 044.0 0.532病程（月） 96（57，147） 72（8，168） 1 973.5 0.180 Age（歲） 62.45±10.04 61.76±10.88 2 225.5 0.713 TJC（關節數） 13（5，18） 14（4，18） 2 194.5 0.614 SJC（關節數） 12（4，16） 12（3，16.5） 2 293.5 0.943 CRP（mg/L） 13.4（0.0，35.5） 8.1（0.01，41.8） 2 099.0 0.517 RF（IU/mL） 155.0（79.3，394.5） 12.9（0.0.82.7） 758.0 0.000 ESR（mm/h） 56.0（31.0，83.5） 43.0（21.5，77.5） 1 806.5 0.052 anti-CCP（U/mL） 149（55，429） 44（8，195） 528.0 0.006 D-Dimer（mg/L） 1.43（0.62，3.03） 0.88（0.46，1.93） 1 723.0 0.053

3 討論

研究發現RA患者的血清中存在多種自身抗體[8-9]。雖然anti-CCP和RF已被廣泛用于RA的診斷，但已證實RF和anti-CCP陰性的RA患者約占RA患者總數的15%～25%[2，10]。且其在很多其他疾病，如系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征、脊柱關節病中也會出現，甚至在老年人中也有一定程度的升高，因此仍有部分患者診斷困難。基于此種現狀尋找RA相關指標，提高RA診斷的敏感性、特異性，實現早期診斷、早期治療成為臨床中亟待解決的問題，也是阻止RA病情發展和降低致殘率的關鍵。為此，筆者進一步探討了血清14-3-3η蛋白與其他生物指標對RA的臨床檢測價值。

14-3-3蛋白是一組高度保守的蛋白家族，由7種亞型（β、γ、ε、η、σ、θ和ζ）組成，在炎性關節疾病患者的關節液和血清中14-3-3蛋白的η和γ2個亞型增高顯著，以η亞型為主，且14-3-3η蛋白水平與基質金屬蛋白酶（MMP）-1和MMP-3顯著相關，說明14-3-3η很可能參與關節損傷機制[4]。Maksymowych等[5]使用與RA患者血清水平相當濃度的14-3-3η蛋白，發現其可激活關鍵細胞信號級聯反應，促進促炎細胞因子和關節損傷因子的轉錄。Carrier等[11]報道盡管在基線水平接受了治療，14-3-3η蛋白水平升高的患者在未來5年內仍然發展出嚴重的關節損傷，尤其是在老年患者中，提示14-3-3η水平升高為不良的預后標志。在接受重組人白細胞介素（IL）-6受體單克隆抗體（單抗）——托株單抗治療的RA患者中，14-3-3η的降低與疾病進展的緩解有關，因此可以作為監測托株單抗療效的生物標志物[12]。此外，14-3-3-η還與RA患者骨質疏松的發生有關，可能是早期RA患者骨質疏松的預測因子[13]。血清和關節滑液中14-3-3η蛋白與已確診類風濕性關節炎患者的放射學損傷和疾病進展密切相關[14]。Tu等[15]報道血清14-3-3-η水平與中國RA患者疾病風險、活動度和病程增加相關。檢測血清14-3-3η水平有助于多發性關節炎患者的早期診斷[11，16]。

本研究中，14-3-3η蛋白的臨界值采用試劑說明書參考為0.2 ng/mL。血清14-3-3η蛋白水平在部分RA患者中升高，在RA組與疾病對照組、RA組與健康對照組之間比較發現，14-3-3η蛋白在RA組中表達明顯高于健康對照組和疾病對照組，提示血清14-3-3η水平可能是預測RA風險的良好指標，這與之前的文獻研究一致[4-5，17]，這可能與14-3-3η參與上調與RA炎癥進展密切相關的促炎細胞因子水平有關。而且Spearman相關性分析發現，RA患者14-3-3η陽性組14-3-3η的表達水平與RF、DAS28-CRP呈正相關，提示14-3-3η可作為監測RA患者病情活動性的一種新的生物標志物。血清14-3-3η蛋白與ESR、D-Dimer呈負相關，與CRP不相關，這與Tu等[15]研究不一致，可能的原因是RA患者14-3-3η表達水平與疾病活動性的相關性是可變的，如果存在關節病變相關組織損傷，14-3-3-η可能獨立于這些指標發揮作用。關節腔內D-Dimer可促進單核細胞IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達，與關節炎癥程度密切相關，早期檢測RA患者D-Dimer水平有利于預防高凝狀態。血清14-3-3η蛋白與D-Dimer呈負相關，考慮與患者入院前是否接受藥物治療有關，另外考慮住院患者一般病情較重，同時統計的樣本量不足也有可能造成一定的影響。本研究中，在RA患者14-3-3η陽性組中，RF與anti-CCP的表達水平也明顯高于陰性組，這種一致性可能是由于14-3-3η、RF和anti-CCP都參與了RA炎癥相關的IL-1β和IL-6的釋放過程[5]。如上所述，14-3-3η能夠誘導促炎性細胞因子的釋放，引起關節損傷，有可能增加RF的表達，從而增加RA的發病風險。

綜上，本研究認為血清14-3-3η蛋白在部分RA患者中高檢測水平，與RA中RF、DAS28-CRP等多個實驗室指標密切相關，有希望成為預測RA風險以及監測RA進展的良好指標。本研究的不足之處在于樣本量較小，后續的研究還需要進一步擴大樣本量來評估14-3-3η蛋白對RA的風險預測和診斷能力，以及它們與疾病進展和治療反應的相關性。同時關于14-3-3η在RA中的具體作用機制也有待深入研究。此外，14-3-3η蛋白與多項指標（包括RF和anti-CCP）的聯合檢測將可能有助于早期發現RA。