花椒葉浸提液對紫云英種子的化感作用

王啟,何靜，張樹衡，丁德東，馬楠，郝琴，吳怡豪

(甘肅農業大學林學院,甘肅 蘭州 730070)

紫云英(Astragalussinicus)為豆科(Leguminosae)良好的綠肥作物，其與根瘤菌共生固氮效率高，并在植株腐解時可有效提升土壤中的氮素含量，而且可以實現綠肥和牧草兼用，具有較高的經濟價值，是建立可持續農林復合生態系統的優良作物之一。花椒(Zanthoxylumbungeanum)屬蕓香科(Rutaceae)植物，為多年生木本油料和香料樹種，是一種集調味、藥用為一體的經濟樹種。甘肅省種植生產的蜀椒、秦椒和貢椒等自古至今均有名，主要分布在隴南、隴東地區[1-2]。目前，間作草本植物以建立多物種組成和多層次結構配置的經濟價值高、生態效益好的坡地花椒農林復合生態系統，已成為當下農林經濟發展的必然趨勢。化感作用對生態系統中植物群落的形成、演替和抗逆性以及作物間選擇最適的連、間、套作方式有重要的影響[3-4]。近年來，利用化感的促進與抑制作用合理選擇間、輪、套作方式解決植物的連作障礙已經成為研究熱點之一[5-6]。

目前，已有報道指出，花椒葉浸提液對4種牧草草地早熟禾、高丹草、苜蓿和白三葉種子的萌發均有一定抑制作用，而對苜蓿和草地早熟禾莖、根生長因濃度不同而表現為“低促高抑”[7]；也有研究表明，大豆生長受到的抑制作用隨花椒葉浸提液濃度的升高而增強[8]。可見，花椒葉浸提液對部分牧草具有一定的化感作用，但對綠肥作物紫云英的化感效應及其機理還鮮有報道。因此，本研究通過不同濃度的花椒葉浸提液處理紫云英種子及幼苗，探明其化感效應，并通過對供試植物體內滲透調節物質及相關防御酶系統的影響研究，揭示花椒化感作用機理，為花椒農林復合經營及科學栽培提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試花椒鮮葉采自甘肅農業大學經濟林教研實踐基地成年“大紅袍”，葉片采集完成后將其置于50 ℃烘箱內風干保存；供試紫云英種子購自甘肅省農業科學院作物研究所。

1.2 方法

1.2.1 花椒葉浸提液的制備 將風干后的花椒葉片剪成大小均勻的碎片，分別取0、10、20、30、40 g干葉于1 000 mL燒杯中，加入900 mL蒸餾水，浸泡24 h后，加水至1.0 L，用3層紗布過濾即得到0、10、20、30、40 g/L的花椒浸提液原液，于4 ℃下保存備用。

1.2.2 種子萌發實驗 采用培養皿濾紙法。選擇性狀優良的紫云英種子，先與細沙混合攪拌摩擦5 min，再用 HgCl2(0.1%)消毒30 s，并用清水沖洗3～5次，用蒸餾水浸泡5 min。將消毒種子置于大小適當并鋪設濾紙的培養皿中。每個培養皿均勻撒放50粒紫云英種子。取等量上述不同濃度的浸提液，分別加入培養皿中，以加入等量的蒸餾水作為對照。然后放入人工氣候箱內，設置溫度為26 ℃，光照為16 h。根據培養皿中濾紙的損傷程度適時更換濾紙并及時補充相應濃度的浸提液。試驗共設5個處理，每處理重復3皿。每天觀察并記錄胚根突破種皮的種子數，記錄結束后統計突破總數即為種子發芽總數，選取6株長勢一致的紫云英幼苗，用游標卡尺測量幼苗根長。發芽率和發芽勢公式計算如下：

發芽率(%)=(胚根突破種皮的種子總數/供試的種子總數)×100%；

發芽勢(%)=(胚根突破種皮最多日種子的數量/供試種子總數)×100%；

1.2.3 相關生理生化指標的測定 可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法；脯氨酸含量的測定采用紫外吸收法；可溶性糖采用苯酚法測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍四唑(NBT)光還原法；過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創木酚法；丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法；過氧化氫酶(CAT)活性、超氧陰離子自由基(O2-)含量和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定均采用紫外吸收法。上述測定方法均參照文獻[9]的方法。

1.3 數據統計分析

1.3.1 化感效應指數(RI)的計算與分析 化感效應指數參照以下公式[10]進行計算：

式中，C為對照值，T為處理值；RI>0代表促進作用，RI<0代表抑制作用。

化感綜合效應(SE)的計算：RI的絕對值表示化感作用強度，化感綜合效應(SE)是指花椒浸提液的化感效應指數的算術平均值[11]，SE絕對值的大小與化感作用強度一致。

1.3.2 數據處理 所有數據均使用Excel 2010進行數據統計整理，用SPSS 19.0軟件在P<0.05水平下進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 花椒葉浸提液對紫云英種子萌發的影響

不同濃度花椒葉浸提液對紫云英種子萌發均呈抑制作用，表現為隨浸提液濃度增加，抑制作用越顯著(P<0.05)(圖1)，且其化感效應指數(RI)越大，以40 g/L時花椒葉浸提液對供試紫云英種子的抑制作用最強(P<0.05)(表1)。

圖1 花椒葉浸提液處理下紫云英種子發芽率及發芽勢

表1 不同濃度花椒葉浸提液對紫云英種子萌發的化感效應指數(RI)

2.2 花椒浸提液對紫云英種子幼苗根長的影響

不同濃度花椒葉浸提液處理對紫云英幼苗根的生長均表現為抑制作用，相較對照，處理根長分別減少了31.2%、38.7%、66.3%、77.5%(圖2)。其中以處理濃度為40 g/L時化感效應最強，對幼苗根長抑制效果最為顯著(P<0.05)(表1)。

圖2 花椒葉浸提液處理下紫云英幼苗根長

2.3 花椒葉浸提液對紫云英幼苗滲透調節物質的影響

隨浸提液濃度增加，紫云英幼苗體內可溶性糖含量表現為先升后降(圖3-A)，在濃度為5 g/L時含量最高；可溶性蛋白和脯氨酸含量均隨浸提液濃度的增大呈逐漸升高的趨勢(圖3-A、圖3-B)。整體來看，隨浸提液濃度增加，紫云英幼苗的滲透調節物質含量也呈增加趨勢(P<0.05)。

圖3 花椒葉浸提液處理下紫云英幼苗滲透調節物質

2.4 花椒葉浸提液對紫云英幼苗防御系統酶活性的影響

不同浸提液處理下紫云英幼苗體內SOD、CAT、PAL活性及MDA、O2-含量均發生明顯變化。具體表現為：隨著浸提液濃度的升高，CAT活性與O2-含量均呈先降后升趨勢(圖4-A、圖4-B)，其中，CAT活性在濃度為10 g/L時最低，O2-含量在濃度為20 g/L時最低。SOD活性隨浸提液濃度的增加呈顯著下降趨勢(圖4-C)，MDA含量則呈顯著升高趨勢(P<0.05)(圖4-D)，PAL活性先升高后降低(圖4-E)，在濃度為20 g/L時最高。表明高濃度的浸提液使紫云英幼苗體內MDA、O2-含量大量積累，加劇了膜脂過氧化程度及細胞膜結構的破壞，從而抑制了相關防御酶的表達，進一步影響了紫云英幼苗的生長。

圖4 花椒葉浸提液對紫云英幼苗防御系酶活性的影響

3 討論

在生態系統中，化感物質主要依靠雨水淋溶產生[12]。因此，本研究通過水浸法提取花椒葉片中的化感物質。結果表明，浸提液濃度越大，其表現出的化感抑制作用越強，整體以濃度為40 g/L時抑制作用最為顯著。

植物體內的保護酶系統能在植株處于逆境時清除體內活性氧，協同抵御外界脅迫。韓志軍等[8]研究發現，花椒葉浸提液對大豆種子MDA含量、SOD活性有顯著影響，陳錫等[13]的研究表明朝倉花椒葉水浸提取物通過破壞白菜幼苗體內的酶系統而抑制其種子萌發和幼苗生長，宋亮[14]的研究顯示花椒水浸液能影響苜蓿幼苗體內的保護酶活性。本研究也得到類似結果。本試驗中，隨著浸提液濃度的升高，紫云英幼苗體內MDA含量逐步升高，導致O2-含量增高、SOD活性降低。Roshchina等[15]研究發現，化感物質中的一些多酚類化合物會破壞細胞膜的功能，可能是受體植物的保護酶活性會受到化感物質影響，導致活性氧增高，從而破壞細胞膜結構。可推測花椒化感效應的一種作用方式是破壞受體植株細胞膜結構。趙紅等[16]在大蒜對大豆的化感作用的研究中也發現類似結果。PAL活性的高低控制著植物體內多種次生酚類化合物、類黃酮植保素等的產生，在植物的次生代謝中具有重要作用，而次生代謝是植物長期演化過程中產生的防御機制[17-19]。本研究表明，隨著浸提液濃度的增大，紫云英幼苗的PAL活性先降低后升高，而CAT活性先降低后升高。這可能是由于高濃度的浸提液產生了較強的化感作用，從而破壞了植株次生代謝的防御機制。

滲透調節能力是植物適應不良生長環境，提高自身抗逆性的基石，植物可通過增大或減少自身滲透調節物質含量來適應環境變化[20]。可溶性糖和可溶性蛋白均為植物體內重要的滲透調節物質，對植物應對環境變化有著不可或缺的作用。Rochaix等[21]研究發現植物受鹽脅迫時，其生長被抑制，植物對糖的利用率下降，可溶性糖含量增加。同時段瑞軍等[22]研究鎘脅迫對海雀稗的影響發現，在受鎘脅迫時，其體內可溶性糖含量增加。本試驗結果表明，隨著化感作用強度的提升，幼苗體內可溶性糖含量先升高后降低，這可能是由試驗材料的不同或處理方法間的差異所致。植物體內的可溶性蛋白大多是參與各種酶的代謝及保護細胞生物膜的合成，遭遇逆境時其含量會發生變化。因此，可通過測定可溶性蛋白含量變化，在一定程度上反映植物抗逆性[23]。李妮亞等[24]認為，多種逆境脅迫作用會抑制植物正常蛋白質的合成途徑而減少其在植物體內的含量，同時有一些植物會被誘導出新的蛋白質或增加原有蛋白質的含量來增強對逆境的適應力。植物在遭受低溫脅迫時，會誘導體內分泌大量的可溶性蛋白[25-26]，在遭受干旱脅迫時，其體內的可溶性蛋白含量變化明顯[27]。杜世章等人發現鹽脅迫下脯氨酸的積累是植物抵御外界脅迫的有效方式[28]。本研究結果表明，隨化感強度的提升，紫云英幼苗體內可溶性蛋白、Pro含量越多，表明紫云英可以通過分泌可溶性蛋白和Pro來抵御體內遭受的傷害。

4 結論

本研究顯示，花椒葉浸提液對紫云英種子萌發及根長均具有一定抑制作用，且隨濃度的增大抑制作用越顯著；同時，通過探究其對紫云英幼苗生理生化指標的影響發現，隨著浸提液濃度的增加，紫云英幼苗體內防御系統相關酶及滲透調節物質變化明顯。由此可知，花椒葉浸提液主要通過抑制紫云英體內的防御酶活性，并對其細胞結構和功能造成傷害而發揮其化感效應。此外，由于花椒樹體多個部位均能產生化感物質，而本試驗僅研究了葉浸提液對紫云英的化感作用，且并未對花椒葉浸提液做成分分析，因此還有待在今后的研究中進一步探明。