EphA2基因沉默對人食管癌EC9706細胞遷移、侵襲的影響及其機制研究

任利兵，賈如江，蘇春永，楊曉光，秦景云

（邯鄲市中心醫院 胸外科，河北 邯鄲056001）

食管癌發生在食管上皮組織，是消化道常見的惡性腫瘤之一，發病率及病死率均較高，對人們生命和健康造成嚴重危害。我國是食管癌發病和死亡人數最多的國家，目前治療手段以手術切除為主，5年內存活率低于30%[1]。食管癌的發生、侵襲及轉移過程極其復雜，其中涉及到多個基因調控異常，癌細胞的侵襲和遷移是食管癌預后差的主要原因之一[2]。促紅細胞生成素產生肝細胞受體（erythropoietin produces hepatocyte receptor, Eph）家族是一類酪氨酸蛋白激酶受體，在腫瘤細胞增殖和遷移相關信號通路中起關鍵調控作用，EphA2 是Eph 家族最早發現的成員，廣泛表達于上皮來源的細胞，參與腫瘤侵襲、轉移過程[3]。研究表明，EphA2 在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤組織和細胞中表達異常升高，促進腫瘤細胞惡性表型行為。高活性的EphA2 與腫瘤上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal-transition, EMT）密切相關，腫瘤細胞發生EMT 后更易發生侵襲和遷移，是早期誘發腫瘤細胞侵襲和遷移的關鍵環節[4-5]。EphA2在食管癌細胞中參與細胞侵襲和遷移機制研究尚少，本研究在RNA 干擾條件下，探討EphA2 對食管癌細胞侵襲和遷移的影響，以期為食管癌的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人食管癌EC9706 細胞購于中國科學院上海細胞研究所。

1.1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640 培養基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素（美國Gibco 公司），Brd U（美國Sigma 公司），含有EphA2 干擾序列（EphA2-siRNA）、無義隨機干擾序列（siRNA-NC）的PGCsi3.0質粒（中國吉凱基因公司），LipofectamineTM2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司），Transwell 細胞培養小室（美國Corning 公司），兔抗人EphA2 單抗、Wnt1 多抗、β-連環蛋白（β-catenin）單抗、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）單抗、波形蛋白（Vimentin）單抗、山羊抗兔IgG-HRP（美國Abcam 公司），PowerPac 系列電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人食管癌EC9706 細胞復蘇后，置于含有10% FBS、100 u/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640 培養液中，于5%的二氧化碳培養箱，37℃恒溫培養，2～3 d 傳代1 次。取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞分組及轉染 將EC9706 細胞隨機分為對照組、空載組及沉默組。轉染前24 h，將細胞按2×105個/孔接種于6 孔板，常規培養，待細胞貼壁良好，融合80%左右時按照LipofectamineTM2000 轉染試劑說明書進行轉染。轉染前4 h，將培養基更換為不含FBS 的RPMI 1640 培養基，取4 μg 質粒（EphA2-siRNA-PGCsi3.0、siRNA-NC-PGCsi3.0） 和10 μL 脂質體，用250 μL 不含FBS 的培養基分別進行稀釋，5 min 內將稀釋后的質粒和脂質體混勻，分別將稀釋后的EphA2-siRNA-PGCsi3.0、siRNANC-PGCsi3.0 復合物加入空載組、沉默組細胞，對照組細胞只加入不含質粒的LipofectamineTM2000，轉染后培養6 h，然后更換為含10% FBS 的RPMI 1640 培養基。轉染48 h 后，熒光顯微鏡下觀察轉染情況，均≥80%，可用于后續實驗。

1.2.3 Brd U法檢測細胞增殖能力 取穩定轉染的各組細胞，按3×104個/mL 密度接種于24 孔板，內附無菌圓玻片，細胞貼壁后，更換含有10 μmol/L的10% FBS 的RPMI 1640 培養基，繼續培養72 h，使用4%多聚甲醛4℃條件下固定過夜，PBS 洗滌×3 次，甲醇固定3 min，加入甲酰胺100℃，5 min 核酸變性，10%山羊血清封閉，加入1∶100 抗小鼠Brd U 單抗（陰性對照加PBS）4℃孵育過夜，加入熒光抗體Cy3（1∶100）室溫避光孵育2 h，DAPI 染色，封片，顯微鏡下觀察拍照，每組隨機選取5 個視野進行計數，計算Brd U 陽性率，Brd U 陽性率=Brd U 陽性細胞數（紅色）/DAPI 陽性細胞數（藍色）×100%。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取穩定轉染各組細胞，按2×105個/孔接種于6 孔板，待各組細胞單層生長鋪滿板底時，用無菌的200 μL 移液槍頭垂直于培養板，在其底部劃一字型劃痕，用PBS洗去劃下的細胞，顯微鏡下觀察拍照（0 h），培養24 h 后，觀察各組細胞劃痕愈合情況并拍照，計算細胞劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0 h 劃痕距離-24 h劃痕距離）/0 h 劃痕距離×100%。

1.2.5 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 用不含FBS 的RPMI 1640 培養基按1∶2 對Matrige1 基質膠進行稀釋，放入培養箱靜置2 h，取10 μL 的Matrigel 膠鋪在Transwell 小室上室，將細胞重懸，調整密度為2×105個/ml，取200 μL 細胞懸液接種于Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含10% FBS的RPMI 1640 培養基，置于培養箱常規培養24 h，取出小室，擦去上室多余細胞，每孔加入1 mL 多聚甲醛固定30 min，用0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗滌細胞后，置于顯微鏡下觀察細胞穿膜情況，并拍照計數，每組細胞重復計數3 次，取平均值。

1.2.6 qRT-PCR檢測細胞中EphA2、Wnt1、βcatenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量 取穩定轉染的各組細胞，Trizol 法提取細胞總RNA，進行核酸定量，按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄cDNA，取5 μL 逆轉錄產物A 進行PCR 擴增。反應體系：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，模板cDNA 2 μL，正反向引物各1 μL，加雙蒸水至總體積20 μL。反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35 個循環。每組設置5 個復孔。以β-actin為內參。引物由上海吉瑪基因公司設計合成，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA 相對表達量。

表1 引物序列

1.2.7 Western blotting 檢測細胞中EphA2、Wnt1、βcatenin、E-cadherin、Vimentin 蛋白相對表達量 取穩定轉染的各組細胞，加入RIPA 裂解液裂解細胞，離心取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，校正上樣量，加入上樣緩沖液，100℃水浴5 min 蛋白變性后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結束后，將蛋白質轉至PVDF 膜上，TBS 洗膜，5%脫脂牛奶封閉2 h 后TBS洗 膜，加入稀釋的EphA2、Wnt1、β -catenin、Ecadherin、Vimentin、β-actin 一抗（1∶2 000），4℃孵育過夜，TBS 洗膜，加入HRP 標記的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBS 洗膜，滴加ECL 化學發光液，曝光、顯影，采用凝膠成像分析系統進行灰度掃描，計算目的蛋白相對表達量，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin 條帶灰度比值表示。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩樣本比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖能力比較

對照組、空載組、沉默組Brd U 陽性率分別為（26.48±2.79）%、（23.52±2.57）%、（13.29±2.06）%，3 組Brd U 陽性率比較，差異有統計學意義（F=38.560，P=0.000）。與對照組、空載組比較，沉默組Brd U 陽性率降低（P＜0.05）；對照組與空載組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 EphA2對細胞增殖能力的影響 （DAPI染色×200）

2.2 細胞遷移能力比較

對照組、空載組、沉默組細胞劃痕愈合率分別為（83.16±8.31）%、（82.35±7.24）%、（34.24±5.27）%。3 組細胞劃痕愈合率比較，差異有統計學意義（F=78.869，P=0.000）。與對照組、空載組比較，沉默組細胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）；對照組與空載組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 EphA2對細胞遷移能力的影響 （DAPI染色×100）

2.3 細胞侵襲能力比較

對照組、空載組、沉默組穿膜細胞數分別為（326.74±33.15）個、（331.27±34.59）個、（126.23±26.18）個。3 組穿膜細胞數比較，差異有統計學意義（F=68.997，P=0.000）。與對照組、空載組比較，沉默組穿膜細胞數減少（P＜0.05）；對照組與空載組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 EphA2對細胞侵襲能力的影響 （0.1%結晶紫染色×100）

2.4 3 組細胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、Ecadherin、Vimentin mRNA相對表達量比較

對照組、空載組、沉默組細胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組、空載組比較，沉默組EphA2、Wnt1、β-catenin、Vimentin mRNA 相對表達量降低（P＜0.05），E-cadherin mRNA 相對表達量升高（P＜0.05）；對照組與空載組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組細胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量比較 （n=5，±s）

表2 3組細胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量比較 （n=5，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與空載組比較，P ＜0.05。

Vimentin mRNA 0.92±0.11 0.90±0.10 0.63±0.07①②14.574 0.000組別對照組空載組沉默組F 值P 值EphA2 mRNA 1.78±0.17 1.82±0.18 0.37±0.11①②38.560 0.000 Wnt1 mRNA 1.26±0.13 1.31±0.13 0.64±0.09①②49.869 0.000 β-catenin mRNA 0.98±0.11 0.95±0.09 0.51±0.08①②39.041 0.000 E-cadherin mRNA 1.01±0.15 0.98±0.14 1.97±0.19①②60.825 0.000

2.5 3組細胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、Ecadherin、Vimentin蛋白相對表達量比較

3 組細胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組、空載組比較，沉默組EphA2、Wnt1、β-catenin、Vimentin 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），Ecadherin蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；對照組與空載組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3 和圖4。

圖4 3組細胞中各蛋白相對表達量

表3 3組細胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達水平比較 （n=5，±s）

表3 3組細胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達水平比較 （n=5，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與空載組比較，P ＜0.05。

Vimentin蛋白0.64±0.07 0.67±0.08 0.25±0.05①②59.674組別對照組空載組沉默組F 值EphA2蛋白1.13±0.11 1.09±0.10 0.21±0.05①②164.878 Wnt1蛋白0.73±0.08 0.71±0.07 0.31±0.04①②65.271 β-catenin蛋白0.86±0.08 0.83±0.08 0.36±0.05①②77.092 E-cadherin蛋白0.57±0.06 0.55±0.07 1.14±0.11①②81.723 0.000 P 值0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

隨著外科水平的提高和放療技術的成熟，食管癌的綜合治療有了很大進步，但由于食管癌細胞侵襲性極強，極易侵襲鄰近部位，治療效果仍不夠理想，術后生存率較低。EphA2 與許多腫瘤細胞的生長和遠處轉移有關，其高表達是多種腫瘤細胞的共同事件，尤其在侵襲性強的腫瘤細胞中表達異常高，且EphA2 的表達也往往隨著腫瘤惡化程度增強而升高[6-7]。利用新興的RNA 干擾技術，通過沉默EphA2基因，阻斷EphA2基因和蛋白合成，從而抑制腫瘤細胞侵襲和遷移，為臨床治療食管癌提供一種新的思路和方法。

細胞遷移是腫瘤侵襲和轉移的關鍵環節，腫瘤細胞與細胞外基質之間的相互作用在腫瘤細胞遷移與侵襲過程中發揮重要作用，引起細胞遷移的必要步驟是細胞與細胞外基質的黏附與解離[8]。EphA2 通過與細胞黏附分子相互作用，促進血管生成，參與調控信號轉導，從而維持細胞之間良好的黏附性[9]。在癌組織中，EphA2 信號轉導發生異常，癌細胞脫離黏附，容易游離，侵襲性增強，進而促進腫瘤細胞惡性表型行為[10]。研究發現，在轉錄水平下調EphA2 的表達可逆轉肝細胞癌細胞遷移及侵襲[11]。EphA2 在神經膠質瘤細胞、前列腺癌細胞中表達較高，并能促進細胞增殖、侵襲和遷移，降低EphA2 表達，可明顯抑制細胞侵襲和遷移等惡性生物學行為[12-13]。本研究對照組EphA2 相對表達量較高，與其在其他腫瘤中表達結果一致[14]，通過轉染EphA2 干擾序列后，細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著下降，提示EphA2基因沉默，對人食管癌EC9706 細胞遷移和侵襲能力具有一定的抑制作用。EphA2 高表達能減弱腫瘤細胞之間的連接，并同時增加腫瘤細胞與細胞外基質的黏附，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，增加患者腫瘤細胞轉移的風險，影響預后[15]。由此表明，通過RNA干擾技術，沉默EphA2基因能在一定程度上抑制人食管癌EC9706 細胞的遷移和侵襲。

EMT 是上皮細胞向間質樣細胞轉化的現象，上皮源腫瘤細胞通過EMT 向周圍組織遷移。EMT發生期間細胞的黏附力減弱，侵襲性增強，同時伴隨上皮標志物E-cadherin 表達下調以及間質標志物Vimentin 和β-catenin 表達上調。E-cadherin 表達下調和β-catenin 核轉位是EMT 的標志性變化，是腫瘤細胞發生遷移和侵襲的基礎條件。Wnt/βcatenin 信號通路參與誘導腫瘤細胞EMT 過程，腫瘤細胞中Wnt/β-catenin 信號通路被異常激活，βcatenin 在胞質中聚集，激活下游靶基因，并可與E-cadherin 結合，形成β-catenin/E-cadherin 復合物，使細胞之間的黏附性減弱，誘導腫瘤細胞EMT，增強細胞遷移和侵襲的能力。在乳腺癌組織中及人胃癌細胞中，Wnt/β-catenin 信號通路與癌細胞的EMT 及侵襲和遷移密切相關[16-17]。本研究對照組Wnt1、β-catenin mRNA 及蛋白相對表達量均較高，提示在Wnt/β-catenin 信號通路人食管癌EC9706 細胞被激活，通過干擾EphA2 表達后Wnt1、β-catenin mRNA 及蛋白相對表達量均下降，E-cadherin mRNA 及蛋白相對表達量升高，Vimentin mRNA 及蛋白相對表達量降低，表明Wnt/β-catenin 信號通路被抑制，并阻止癌細胞EMT，提示EphA2基因沉默抑制人食管癌EC9706 細胞侵襲和遷移，可能與癌細胞內Wnt/β-catenin 信號通路失活相關。

綜上所述，EphA2基因沉默對人食管癌EC9706 細胞遷移和侵襲具有一定的抑制作用，其作用機制可能與Wnt/β-catenin 信號通路失活相關，抑制細胞EMT，降低細胞增殖、遷移和侵襲能力，為臨床治療食管癌提供實驗依據。EphA2基因在多種腫瘤細胞中高表達，且與腫瘤細胞遷移和侵襲也存在一定的相關性，是否為人食管癌及其細胞遷移和侵襲的特異性基因或標志靶點，尚需進一步深入研究。