基于Nrf2/HO-1 信號通路研究芝斛方對氧化應激小鼠的抗氧化作用及機制

樂 娜，吐爾遜·熱依拉，侯新娟，劉金蓮，王林元，王 淳，張建軍

（北京中醫藥大學，北京 100029）

我國人口老齡化給社會、家庭帶來嚴重的問題，且老年人容易患糖尿病、高血壓、高脂血癥等疾病，因此保持中老年人的健康狀態、降低與氧化衰老相關疾病的發生發展、延長健康壽命成為生命科學探索的重要目標。抗氧化功能可調節機體氧化/抗氧化系統的平衡，清除自由基，減少自由基對機體損傷。抗氧化作用主要依賴于SOD、GSH-Px、CAT 等抗氧化酶的活性，核因子E2 轉錄因子2（Nrf2）作為內源性抗氧化系統中的關鍵元件，對氧化應激具有高度敏感性[1]，可通過Nrf2 信號通路調控抗氧化酶/蛋白的表達，從而調節抗氧化酶的活性，此外，NO也與氧化損傷密切相關。國醫大師王琦教授將體質分為9 種類型，有文獻研究顯示，氣虛質、陰虛質及其兼夾體質是中老年人的常見體質類型[2-3]，基于中老年人這一特點自擬具有益氣養陰功效的芝斛方，研究芝斛方對氧化應激小鼠抗氧化酶、過氧化物及Nrf2/HO-1 信號通路的影響，將中醫益氣養陰功效與抗氧化作用聯系起來，探明中醫益氣養陰與抗氧化作用的關系，為抗氧化中藥復方保健產品的“功能-功效”研究方法的建立奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級健康雄性昆明小鼠，體質量18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，合格證編號：SCXK（京）2016-0002。飼養于北京中醫藥大學SPF 級動物房。破壁靈芝孢子粉（批號：20191001）和鐵皮石斛（批號：20191001）由浙江壽仙谷醫藥股份有限公司提供，西洋參（批號：17092003）、三七粉（批號：18011101）及葛根（批號：19011101）均購自北京同仁堂股份有限公司，生脈顆粒（黨參方）（批號：190301，規格：每袋10 g）。SOD 試劑盒（批號：20190829）、GSH-Px試劑盒（批號：20190826）、T-AOC 試劑盒（批號：20191128）、MDA 試劑盒（批號：20190830）、CAT 試劑盒（批號：20190829）、蛋白質羥基（PC）試劑盒（批號：20191206）、NO試劑盒（批號：20191129）、NOS 試劑盒（批號：20191128），以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Nrf2 試劑盒（批號：N26018737）和血紅素氧合酶1（HO-1）試劑盒（批號：N25018738）購自武漢華美生物，95%乙醇（北京化工）；紫外分光光度計（型號：752-P，上海現科儀器有限公司）、全自動研磨儀（型號：KH-III，武漢賽維爾生物）、冷凍離心機（型號：neofuge 15R，heal force）、全自動放免技術儀（型號：XH-6020，西安核儀器廠）、A6 半自動生化儀（編號：HY-YQ-02，北京松上技術有限公司）、酶標分析儀（型號：DR-200BS，無錫華衛德朗儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 芝斛方由破壁靈芝孢子粉1 g，鐵皮石斛1.5 g，西洋參1.5 g，葛根3 g，三七粉1 g 組成。取鐵皮石斛（36 g），西洋參（36 g），葛根（72 g），加蒸餾水浸泡1 h，煎煮提取2 次，每次1 h，加水量分別為12 倍、10 倍。提取液用濾布趁熱過濾、合并，減壓濃縮至700 mL 后加入破壁靈芝孢子粉（24 g）、三七粉（24 g），再加蒸餾水至720 mL，每1 mL 含生藥約0.267 g，即得高劑量芝斛方藥液；再取所得藥物混懸液240 mL，加蒸餾水稀釋1 倍，即加水至480 mL，即得低劑量芝斛方藥液，4 ℃冷藏，備用。

生脈顆粒灌胃藥的制備：稱取適量顆粒劑放入燒杯中加入適量溫水，攪拌均勻，直至全部溶解。

1.2.2 分組和給藥 雄性昆明小鼠40 只，適應性喂養7 d 后隨機分為空白組、模型組、生脈顆粒組（5 g/kg，相當于人30 g/d）、芝斛方高劑量組（2.67 g/kg，相當于人16 g/d）、芝斛方低劑量組（1.33 g/kg，相當于人8 g/d），每組8 只。每天上午給予空白組、模型組小鼠生理鹽水，其余各組給予相應藥物，連續給藥30 d。

1.2.3 造模方法 依據2012 年國家食品藥品監督管理局發布的抗氧化保健功能評價方法造乙醇氧化損傷模型，即末次灌胃后，除空白組外其余各組禁食16 h（過夜），然后1 次性灌胃50%乙醇12 mL/kg，制備小鼠氧化應激模型，6 h 后取材。

1.2.4 檢測指標 采用比色法檢測SOD、CAT、GSHPx、GST 活性及MDA 和PC 含量，采用ABTS 法檢測小鼠血清T-AOC 能力，采用酶聯免疫吸附法檢測小鼠肝臟組織Nrf2 和HO-1 含量，采用比色法檢測肝臟組織NO含量和NOS活性。具體操作按試劑盒說明進行。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS Statistics 20.0 進行統計學分析，實驗數據符合正態分布，以均數±標準差（）表示，組間數據比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較方差齊時采用LSD 進行統計分析；方差不齊采用Dunnett’s T3 進行統計分析。

2 結果

2.1 芝斛方對氧化應激小鼠血清抗氧化酶及T-AOC 的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清中SOD、GSHPx、GST 活性及T-AOC 均顯著下降（P＜0.001，P＜0.01）；與模型組比較，給藥芝斛方各組小鼠血清SOD 活性及T-AOC 增強（P＜0.001，P＜0.01），芝斛方高劑量組GSH-Px 和GST 活性增強（P＜0.001）。見表1。

表1 芝斛方對氧化應激小鼠血清抗氧化酶及T-AOC 的影響（，n =8）

表1 芝斛方對氧化應激小鼠血清抗氧化酶及T-AOC 的影響（，n =8）

注：與空白組比較，## P ＜0.01，### P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

2.2 芝斛方對氧化應激小鼠氧化產物MDA 和PC 的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清MDA 含量及肝臟組織MDA 和PC 含量顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，芝斛方各劑量組小鼠肝臟組織中MDA含量明顯下降（P＜0.05），芝斛方高劑量組小鼠血清MDA 及肝臟組織中PC 含量下降（P＜0.001，P＜0.01）。見表2。

表2 芝斛方對氧化應激小鼠氧化產物MDA 和PC 的影響（，n =8）

表2 芝斛方對氧化應激小鼠氧化產物MDA 和PC 的影響（，n =8）

注：與空白組比較，### P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

2.3 芝斛方對氧化應激小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px、Nrf2 和HO-1 的影響 與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織中GSH-Px 活性、Nrf2 及HO-1 含量均明顯降低（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟組織中GSH-Px 活性及Nrf2、HO-1 含量顯著升高（P＜0.001，P＜0.05）。見表3。

表3 芝斛方對氧化應激小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px、Nrf2 和HO-1 的影響（，n =8）

表3 芝斛方對氧化應激小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px、Nrf2 和HO-1 的影響（，n =8）

注：與空白組比較，### P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05，△△△P ＜0.001

2.4 芝斛方對氧化應激小鼠肝臟NO 和NOS 的影響 與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織中NOS 活性增強，NO 含量升高（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組相比，各給藥組小鼠NO 含量下降，NOS 活性降低（P＜0.01，P＜0.001）。見表4。

表4 芝斛方對氧化應激小鼠肝臟NO 和NOS 的影響（，n =8）

表4 芝斛方對氧化應激小鼠肝臟NO 和NOS 的影響（，n =8）

注：與空白組比較，### P ＜0.001；與模型組比較，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

3 討論

芝斛方是在中醫基礎理論的指導下，根據方證相應、藥證相關原則，結合中醫臨床經驗配伍而成，組方選用破壁靈芝孢子粉、鐵皮石斛、西洋參、葛根及三七5 味藥，主要針對氣陰兩虛型中老年人，以期達到益氣養陰功效和抗氧化作用。其中靈芝孢子粉可扶正固本，補氣安神，鐵皮石斛可滋陰清熱去虛火，二者同用可補氣養陰；西洋參、三七既能增強靈芝孢子粉補氣的功效，又可增強石斛養陰生津之效。葛根能助石斛、西洋參養陰生津之效，5 味藥同用可益氣而不助熱，養陰而不滋膩。現代研究表明，破壁靈芝孢子粉及其多糖類、三萜類、甾醇類等成分都具有明顯抗氧化作用[4-6]；鐵皮石斛作為“民間仙草”也常作為抗氧化、增強免疫力等保健食品的原料[7]；現代研究表明，傳統中藥西洋參對自由基有較強的清除能力[8-9]；三七中含有三七總皂苷、多糖、黃酮及三七素等多種化學成分，在抗衰老、抗疲勞等方面都具有較好的作用[10-11]；葛根中的葛根素、葛根多糖等成分對自由基及亞硝酸鹽等都有較強的清除作用[12-13]。

氧化應激是指機體內氧化系統和抗氧化系統的平衡被打破，從而引發細胞內生物大分子如糖類、脂質、蛋白質以及核酸等被破壞，進一步導致器官、組織結構和功能的損傷，而這些損傷又會導致氧化產物的進一步堆積從而加重損傷，形成一個惡性循環[14-15]。抗氧化系統則是機體針對各種氧化損傷做出的反應，以減輕氧化損傷。Nrf2/HO-1 信號通路是機體防御氧化應激的重要機制，Nrf2 可幫助維持線粒體生理功能、細胞氧化還原反應以及蛋白質的正常功能[16-18]。正常情況下它與Keap1 分子結合在一起，但受到外來物質的刺激時，可通過與ARE 蛋白結合來激活下游靶蛋白的轉錄[19]，調控二相解毒酶及抗氧化酶蛋白的表達[20]。HO-1 基因的表達受到Nrf2 調控，當Nrf2 被激活后可促進HO-1 的表達，HO-1 的表達上調又可調節SOD、GSH-Px、CAT 等抗氧化酶活性。抗氧化酶可將機體內的自由基分解為水和分子氧，減少氧化應激損傷，機體氧化產物MDA 和PC 的產生也會減少[21]。T-AOC是衡量機體內抗氧化能力的最優指標之一。實驗結果顯示，小鼠受到乙醇急性氧化應激損傷后，肝臟組織中Nrf2 含量下降，HO-1 表達減少，血清和肝臟組織中SOD、GSH-Px、T-AOC 水平下降，MDA 和PC 含量升高，給與芝斛方干預的小鼠肝臟組織中Nrf2 和HO-1 含量均顯著升高，血清中SOD 和GSH-Px 活性增強，T-AOC 也明顯高于模型組，MDA 和PC 含量降低。表明芝斛方可以通過調節Nrf2/HO-1 通路來增加機體抗氧化酶活性，減輕脂質和蛋白質的過氧化，拮抗氧化損傷。GSH 在GST 的催化作用下可與活性氧等自由基結合，對細胞活性氧的防御起重要作用[22]。本研究結果表明芝斛方高劑量組GST 活性可上升至正常水平以上，表明芝斛方在保護細胞免受氧自由基損傷中起關鍵作用，而這種保護作用可能與調節GST 的活性密切相關。

NO 是由NOS 催化L-精氨酸胍基末端氮發生氧化反應而生成[23-24]，在體內有廣泛的生理作用。低濃度NO 可以抵抗氧化損傷[25]，而高濃度的NO 則會加重機體的氧化損傷。NO 含量主要受到NOS 的影響，肝臟細胞中含有豐富的NOS 酶，當它們被激活后會生成大量內源性NO[26]。NO 極易被氧化成NO2，進而以NO2-和NO3-的形式存在于組織液中；此外NO 與O2反應還可生成具有強氧化作用的超氧化亞硝基陰離子（ONOO-），引發脂質過氧化連鎖反應。因此當內源性NO 大量生成時，極易引起氧化應激損傷。實驗結果表明，急性氧化應激損傷后的小鼠肝臟組織中NOS酶活性明顯增強，NO 含量明顯升高；而給藥芝斛方的各組小鼠NOS 酶活性和NO 含量顯著下降。表明乙醇可以誘導肝臟細胞中NOS 被激活從而引起NO 大量產生對機體造成氧化應激損傷，而芝斛方可以通過降低NOS 酶活性，減少NO 的產生，抵抗氧化應激損傷。

綜上可知，具有益氣養陰功效的芝斛方對酒精性氧化應激小鼠有抗氧化作用，其抗氧化作用的發揮從多個方面來表現，首先芝斛方可以通過調控Nrf2/HO-1信號通路來調節體內SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶活性，增加機體總抗氧化能力以清除自由基，減少氧化產物的生成來拮抗氧化應激損傷。此外還可抑制NOS 活性，減少內源性NO 的產生，從而發揮抗氧化作用。