肺泡灌洗液宏基因組二代測序技術在重癥肺炎患者中的臨床價值*

陳友蓮，劉雪燕，陳懷生，洪澄英，張華東

(深圳市人民醫院重癥醫學科，廣東 深圳 518020)

由細菌、真菌或病毒引起的肺部感染在世界范圍內的發病率和死亡率均逐步上升，是導致總壽命下降的第三大原因[1]。因此需要進行機械通氣的重癥肺炎死亡率為30%～70%，病原體通常為革蘭陰性菌，如不動桿菌屬、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌、革蘭陽性菌，如金黃色葡萄球菌和腸球菌及一些病毒等[2]。傳統的病原體檢測方法陽性率低且耗時，不能滿足當前對快速和精準感染性疾病診斷的需求[3]。宏基因組二代測序技術(mNGS)是一種高通量測序方法，可以檢測病原微生物和標記基因，例如抗生素抗性基因等，檢測效率高且周轉時間短，從而有可能快速、準確診斷感染性疾病病原體[4]。關于mNGS在重癥肺炎患者病原學診斷中的應用報道仍然很少，特別是使用肺泡灌洗液(BALF)樣本進行檢測的研究。本研究對收治的58例重癥肺炎患者的臨床資料進行回顧性分析，以探討肺泡灌洗液mNGS 在重癥肺炎患者病原檢測及指導治療方面的臨床應用價值，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析 2019 年 1 月至 2021 年 1 月深圳市人民醫院收治的 58 例行支氣管鏡肺泡灌洗液mNGS檢測及傳統培養檢測的重癥肺炎患者的臨床資料。重癥肺炎診斷標準標準按照2007年美國感染病學會(IDSA)/美國胸科學會(ATS)制定的標準進行診斷[5]。其中男30 例，女28 例；年齡 25～78歲，平均(62.5±12.0)歲。本研究為回顧性研究，肺泡灌洗液標本采集及mNGS檢測已得到患者授權家屬同意，并簽署知情同意書，符合醫學倫理學原則，并獲得深圳市人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1標本采集[6]充分做好術前準備，簽署知情同意書。根據臨床體征及影像學檢查確定目標灌洗肺段，2%利多卡因行表面麻醉，根據鏡下所見將纖維支氣管鏡插入至病變最為嚴重的肺段,分次快速注入 37 ℃ 滅菌生理鹽水，每次 25～50 mL灌洗病變肺段支氣管,灌洗后負壓吸引回收灌洗液(一般回收率為 30%～50%),裝入無菌容器中。肺泡灌洗液收集后將其分成2個相等的部分,瓶身標記患者信息，1份樣本送至本院的微生物室進行涂片,培養，另1份樣本即刻于-20 ℃冰箱保存后立即聯系專業人員送往華大基因醫學檢驗實驗室行mNGS檢測。

1.2.2mNGS病原學檢測[7]按上述步驟收集合格樣本，提取核酸進行高通量測序，對樣本中微生物 DNA 序列進行生物信息學分析得出檢測結果，最后臨床醫生綜合檢測結果及臨床特征進行綜合判斷，進一步指導臨床診療。

1.2.3觀察指標 觀察患者的基線資料，包括年齡、性別、合并基礎性疾病、疾病嚴重程度、器官支持治療措施、肺泡灌洗液常規培養及mNGS檢測病原學分布、抗生素調整、重癥監護室(ICU)住院時間、治療轉歸等。比較肺泡灌洗液常規培養及mNGS病原體各自檢測情況(病原體陽性比例、種類分布、二者吻合程度及多重感染比例等)。

2 結 果

2.1患者基線資料 本研究共計納入58例患者，其中男性患者為 30 例(51.7%)，患者總體的平均年齡(62.5±12.0)歲，研究對象中有42例患者合并一種甚至多種基礎疾病，其中胃腸腫瘤圍手術期25例(43.1%)。患者急性生理功能和慢性健康狀況評分系統Ⅱ(APACHEⅡ)和序貫器官衰竭評分(SOFA)分別為22、10分，說明患者病情危重。其中納入有所有患者均為有創機械通氣，16例(27.6%)患者進行了俯臥位通氣，38例(65.5%)患者出現休克，30例(51.7%)患者需要腎臟替代治療，8例(13.8%)患者甚至進行了體外膜氧合支持治療。經mNGS檢測后抗生素調整患者有25例(48.1%)。所有患者ICU平均住院時間20.8(7，38)d，死亡率為31.0%(18例)。

2.2肺泡灌洗液 mNGS與傳統培養的病原體分布 53例肺泡灌洗液 mNGS 檢測陽性患者中，共檢測到病原體 209 株，其中細菌有155 株(鮑曼不動桿菌 30株，嗜麥芽窄食單胞菌23株，銅綠假單胞菌 18 株，肺炎克雷伯菌17株，皮特不動桿菌8株，屎腸球菌9株，肺炎鏈球菌6株，大腸埃希菌6株，糞腸球菌4株，流感嗜血桿菌 3 株，紋帶棒狀桿菌3株，以及其他包括嗜肺軍團菌2株，解甘露醇羅爾斯菌2株，金黃色葡萄球菌2株)，病毒 29株(人類皰疹病毒 1 型 11 株，巨細胞病毒 7 株，細環病毒4株，EB病毒3株)，真菌19株(光滑念珠菌5株，近平滑念珠菌5株，白色念珠菌5株，熱帶念珠菌 3 株，煙曲霉 1 株)，特殊病原體 11 株(鸚鵡熱衣原體2 株，解脲支原體2株耶氏肺孢子菌4株，隱球菌2株，結核分枝桿菌 1 株)。19例培養陽性患者中，共檢測到病原體 65株，其中細菌57株(鮑曼不動桿菌 10株，嗜麥芽窄食單胞菌12株，銅綠假單胞菌6株，肺炎克雷伯菌 8株，大腸埃希菌3株等)，真菌15株(光滑念珠菌3株，近平滑念珠菌4株，白色念珠菌5株，熱帶念珠菌 1 株，煙曲霉1株)。特殊病原體和病毒未檢測出。由此可以看出，肺泡灌洗液mNGS對細菌、病毒及特殊病原體的檢測陽性率明顯高于常規培養檢測方法。見圖1。

圖1 肺泡灌洗液mNGS和常規培養病原學分布

2.3mNGS 陽性率與傳統培養靈敏度、特異度、吻合程度比較 肺泡灌洗液mNGS較常規培養的靈敏度提高了約59.0%(92.0%vs.32.3%；P<0.05)，特異度降低了23.7%(58.8%vs.82.5%；P=0.38)。與常規培養相比，mNGS提高了靈敏度(P<0.05)，而二者之間特異度差異無統計學意義(P=0.38)。肺泡灌洗液mNGS和常規檢測病原體均為陽性17例(29.3%)，3例(5.7%)均陰性；僅mNGS檢出病原體陽性36例(62.0%)，僅肺泡灌洗液培養病原體陽性2例(3.4%)。在17例雙陽性病例中，肺泡灌洗液mNGS和常規培養結果完全匹配13例，完全不匹配2例，部分不匹配2例。

2.4肺泡灌洗液mNGS檢測混合感染的作用 在58例患者中，肺泡灌洗液mNGS檢測未發現病原體有2例(3.4%)，發現僅1種細菌感染有7例(12.0%)，僅1種真菌感染有1例(1.7%)，細菌真菌混合感染13例(22.4%)，細菌病毒混合感染12例(20.7%)，多細菌混合感染14例(24.1%)，真菌病毒混合感染1例(1.7%)。其中細菌真菌病毒混合感染6例(10.3%)，細菌真菌病毒及支原體混合感染2例(3.4%)。結合患者病情及免疫功能指標，作者發現免疫功能正常患者主要為一種病原體感染或細菌合并真菌感染或多細菌合并感染，而在免疫功能抑制的患者中，細菌-真菌-病毒混合性感染比較常見。

3 討 論

早期病因診斷對于重癥肺炎患者合理使用抗生素非常重要。傳統的診斷技術主要包括涂片顯微鏡檢查，微生物培養，抗原抗體檢測和PCR等這些評估方法耗時、檢測范圍窄且陽性率低，不能滿足重癥肺炎患者的診斷需求[8]。隨著分子生物學的發展，mNGS檢測的價值已逐漸得到認可，特別是對于一些稀有、非典型或生長緩慢的微生物的檢測[9]、現有檢測技術無法識別的病原體以及對標準化抗菌治療無效的患者[10]。有研究表明，重癥肺炎患者氣道菌群組成受機械通氣時間的影響，隨著發病時間的延長，細菌菌群的類型可能會發生變化，這可能是細菌菌群遷移的結果[11]。而且mNGS可以識別不同條件下的氣道菌群分布，有助于迅速和準確的治療肺部感染[12]。常規檢測方法顯示，革蘭陰性桿菌是最常見的病原體(41%～92%)，如鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、克雷伯菌、大腸桿菌、變形桿菌等。其次是革蘭陽性球菌，如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)、萬古霉素耐藥金葡菌(VRSA)和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)等。其他的還包括念珠菌等真菌[13]。本研究表明，常規培養與肺泡灌洗液mNGS的檢測病菌體分布基本一致，但后者檢測靈敏度高于常規培養(91.3%vs.32.3%，P<0.05)，而特異度低于常規培養(58.8%vs.82.5%,P=0.25),且受先前抗生素暴露的影響較小[14]。而且在一些少見病原體(如嗜肺軍團菌、紋帶棒狀桿菌、李斯特菌、耶氏肺孢子菌、隱球菌、鸚鵡熱衣原體等)檢測方面則更具有優勢，可以迅速確診并進行靶向抗感染治療。此外，肺泡灌洗液mNGS在檢測病毒方面優勢非常明顯。本研究中，共檢測到29株病毒，最常檢測到的病毒為單純皰疹病毒1型11株、巨細胞病毒7株、細環病毒4株，EB病毒3株。既往有研究表明，合并病毒感染重癥肺炎患者的預后更差[15]。本研究中，因發現病毒而調整治療方案約占45%。因此，通過肺泡灌洗液mNGS檢測及早識別一些少見、致病性病毒具有非常重要意義，可以幫助我們盡早做出合理的醫療決策。

mNGS的另一個優點是其可以在一次檢測中同時檢測多種病原體。病程遷延、免疫抑制的患者更有可能成為mNGS的最大受益者，因為這一類患者通常為混合感染[16]。本研究中，多細菌混合感染占24.1%，細菌真菌混合感染占22.4%，細菌病毒混合感染占20.7%，真菌病毒混合感染占1.7%，細菌真菌病毒混合感染占10.3%，細菌真菌病毒及支原體混合感染占3.4%，合計有82.8%病例為混合感染。對于混合感染，聯合治療是常見策略，因此應盡早、動態使用mNGS檢測細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原微生物，實現精準治療，從而減少不必要和不適當的抗生素使用，避免抗生素濫用和耐藥發生[17]。

本研究表明，肺泡灌洗液mNGS在重癥肺炎治療中具有非常重要的作用，但仍然存在一些局限性。(1)除了人類基因組干擾和其他常見問題之外，mNGS結果的解釋(即區分定植與感染)仍然存在問題，也是今后需要研究的方向；(2)本研究中未進行肺泡灌洗液RNA病毒檢測，有可能漏診一部分RNA病毒感染患者，降低診斷靈敏度。這可能與目前mNGS檢測費用較高有關，隨著技術的進步及檢測成本降低，這一問題有望解決；(3)目前的肺泡灌洗液mNGS雖然可提供耐藥基因檢測，但仍無法提供耐藥細菌藥敏檢測等重要信息；(4)本研究為回顧性研究，病例數有限，仍需要更多前瞻性和多中心數據才能得出關于肺泡灌洗液mNGS檢測在臨床應用確實有效的證據。

綜上所述，肺泡灌洗液mNGS能夠快速、準確地檢測和鑒定病原體，為精準診斷和個性化治療奠定了基礎；此外，在診斷重癥肺炎患者混合感染方面也具有明顯優勢，是一種有前途的臨床感染性疾病診斷技術。