茶樹開花相關基因家族的克隆及CsMFT基因的可變剪切分析

黃 瑞，夏華富，代洪葦，袁連玉，童華榮

(西南大學 食品科學學院，重慶 400715)

茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]是雙子葉植物山茶屬多年生常綠木本經濟植物，起源于中國西南地區。茶樹葉片和茶樹花分別作為茶樹組織器官和生殖器官在生產和應用上起著重要作用，茶樹葉片經加工后因其獨特的風味和有益健康的特性受到廣泛歡迎，茶樹花也因為其豐富的內含成分應用于食品、醫藥、園藝鑒賞等領域[1]。茶樹生長過程包括營養生長和生殖生長兩種生長狀態，這兩種狀態相互競爭水分和營養物質[2]。營養生長有益于茶樹葉片的生長發育，獲取高品質的茶葉，生殖生長有益于茶花生長發育，維持物種多樣性，但生殖生長旺盛消耗茶樹養分抑制營養生長，導致茶葉產量質量下降，降低經濟效益[3]。開花誘導是植物從營養生長到生殖生長的開端，研究茶樹成花調控機理和花芽分化相關機制有益于調控茶樹營養生長和生殖生長，提高茶葉和茶樹花的產量和品質，為茶葉經濟發展以及良種選育提供依據。

植物開花是一個受多通路調節且連續、復雜的過程，植物進入成花誘導階段，經信號傳導后再進入成花決定狀態，開花整合子激活花分生組織相關基因的表達，進行花芽分化和花器官發育形成[4]。開花誘導是植物從營養生長到生殖生長的重要過渡，研究表明植物開花誘導調控途徑分為5類，分別是光周期途徑(photoperiod pathway)、春化途徑(vernilization pathway)、自主途徑(autonomous pathway)、赤霉素途徑(GA pathway)和年齡途徑(aging pathway)[5-6]。其中，光周期、春化途徑與受外界刺激相關，赤霉素、自主和年齡途徑受到內源信號的調節[7]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)開花調控途徑和相關基因的研究較其他植物更為成熟，FT(FLOWERINGLOCUST)基因和TFL1(TERMINALFLOWER1)基因這一對同源基因最先在擬南芥中被鑒定出來[5]，是擬南芥開花調控途徑中的關鍵基因[8]。FT基因與TFL1基因屬于PEBP基因家族，共同編碼磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding protein, PEBP)。在被子植物中，PEBP蛋白家族成員既能參與開花過程的調控，也能參與植物的形態建成，可分為3個亞家族FT-like、MFT-like和TFL1-like，包括FT(FLOWERING LOCUS T)、TFL1(TERMINAL FLOWER 1)、TSF (TWIN SISTER OF FT)、BFT (BROTHER FT AND TFL1)、 ATC (ARABIDOPSIS THALIANA CENTRORADIALIS)及MFT (MOTHER OF FT AND TFL1)[9]。研究表明，在擬南芥中AtFT、AtTSF和AtMFT基因促進開花，而AtTFL1、AtATC和AtBFT基因抑制開花[10-13]。

FT基因編碼的FT蛋白是“成花素”的主要構成部分，它可通過植物韌皮部被運輸至莖頂端分生組織與FD蛋白作用，形成促使花分生組織表達的復合體，促進植物開花[14-15]。FT基因是成花調控多種途徑的關鍵結合點，它整合了光周期、春化、赤霉素、自主等途徑的誘導信號，是植物成花過程中重要的整合因子[16]。目前，FT基因在其他植物中也有相關研究，如小麥(Triticumaestivum)VRN3基因[17]、水稻(Oryzasativa)Hd3a基因[15]、蘋果(Malusdomestica)MdFT1和MdDF2基因[18-19]、番茄(Solanumlycopersicum)SP基因和玉米(Zeamays)ZCN8基因[20]等。TFL1基因與植物營養生長相關，TFL1基因與FT基因具有高度相似性，但TFL1蛋白與FD蛋白作用，其功能與FT蛋白相拮抗，表現為抑制花原基形成，能夠延遲開花[21-22]。TFS基因與FT基因也具有高相似性，其表達模式和組織表達部位相似，在擬南芥中TSF基因過表達使開花提前，表明TSF基因具有成花誘導作用[23]。MFT基因與FT基因功能相似，有較弱的開花誘導作用，但主要作用是通過赤霉素和脫落酸調控種子萌發[4, 24-25]。

可變剪切(alternative splicing, AS)是指不均一核RNA(hnRNA)轉錄位點被剪切體選擇性剪切產生不同的mRNA異構體的現象[26]。在真核生物中普遍存在可變剪切現象，超過60%的外顯子基因經可變剪切后形成不同的轉錄本類型，增加了蛋白質類型和功能的多樣性[27]。可變剪切在植物生長中起重要作用，在轉錄后對調節植物的生長、發育、非生物脅迫的響應起作用，有利于植物適應環境和改善植物表型[28]。外顯子跳躍(exon skipping)、內含子保留(intron retention)、5′端可變剪接(alternative 5′ splice site) 和 3′端可變剪接(alternative 3′ splice site)是植物中主要的剪切方式[29]。目前，茶樹開花調控的相關作用機制尚未完全明確，關于茶樹開花調控的相關基因的報道也較少。本研究鑒定并克隆了茶樹中的5個PEBP基因家族成員，并進行了全面的生物信息學、啟動子及時空表達特異性分析。并在實驗過程中發現茶樹CsMFT基因存在2個不同的轉錄本，可為進一步研究茶樹開花相關基因的功能提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究采用的試驗材料為3年生‘南川大茶樹’扦插苗，種植于西南大學校內茶樹種質資源圃。轉錄組數據庫來源于TPIA數據庫(http://tpdb.shengxin.ren/Blast.html)，所用茶樹品種為‘舒茶早’。不同開放程度的茶樹花(花苞、露白、半開、全開、盛開)用于基因表達模式分析，取樣地點為重慶市南川區，品種為‘南川大茶樹’，液氮速凍后于-80 ℃冷凍保存。

1.2 方 法

1.2.1 茶樹開花相關基因的鑒定及克隆根據擬南芥中開花相關基因的研究，在TAIR數據庫(http://arabidopsis.org)中下載6個開花相關基因的序列信息，在茶樹基因組數據庫TPIA中利用本地Blast檢索獲得5個茶樹開花相關基因。以3年生扦插苗的芽頭、葉片、嫩莖、根部作為材料，品種‘南川大茶樹’通過艾德萊EASY spin 植物RNA快速提取試劑盒，提取其總RNA，用NoVoScript Plus All-in-one 1st strand cDNA Synthesis Super Mix合成第一鏈cDNA。采用Primer3對獲取到的基因CDS序列設計相應的引物(表1)，使用Prime STAR Max DNA Polymer酶進行基因擴增，經1%瓊脂糖凝膠檢驗后，用TAINgel MiDi Purification Kit瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收相應的片段；將回收到的片段連接到pMD18-T載體上，通過熱激轉化大腸桿菌EcoliDH5，挑取單菌落至含AMP抗生素的LB培養基上劃線培養，經菌落PCR擴增后將陽性克隆菌液送至生工公司測序。

表1 引物序列信息

1.2.2 生物信息學分析采用軟件ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)分析茶樹開花相關基因編碼蛋白的氨基酸數目、分子量、等電點，并在 Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)網站上對蛋白質的亞細胞定位進行分析。分別利用在線軟件SOPM (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)和SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive/)對5個茶樹開花相關基因蛋白質的二、三級結構模型進行分析。采用DNAMAN軟件對茶樹開花相關基因的氨基酸序列進行多序列比對，并基于鄰接法在MEGA 4軟件中構建6個物種(擬南芥、水稻、甜橙、葡萄、楊樹及茶樹)PEBP基因家族的系統發育進化樹。通過在線軟件MEME(http://memesuite.org/)對茶樹開花相關基因保守基序的進行分析，其中motif基序最大值設定10。在茶樹基因組數據庫TPIA中，獲取茶樹開花相關基因在茶樹不同組織部位以及在不同逆境脅迫條件下(高鹽、低溫、干旱和外源激素MeJA)的表達水平等數據，通過軟件Tbtools制作熱圖。根據chen[30]構建的染色體規模基因組信息，在其文獻中下載染色體規模基因組模型信息，通過基因編號檢索基因在染色體中的位置，獲取染色體起始位點信息，在MAPchart軟件中對基因染色體位置信息進行可視化。在茶樹基因組TPIA中下載茶樹開花相關基因翻譯起始密碼子前2 kb的啟動子區域序列，利用在線軟件Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測順式作用元件的類型和數量，并采用TBtools軟件繪制茶樹開花相關基因啟動子中的順式作用調控元件。

1.2.3 基因表達模式分析以不同開放程度的茶樹花(花苞、露白、半開、全開、盛開)為實驗材料，使用EASY spin植物RNA快速提取試劑盒提取其RNA，以2 μg RNA為模板采用NoVoScript Plus All-in-one 1st strand cDNA Synthesis Super Mix逆轉錄合成cDNA，稀釋20倍作為熒光定量PCR模板。利用Primer3軟件設計熒光定量PCR引物(表1)，選用已登錄的TUBA基因為內參基因，采用熒光定量PCR方法對其進行表達分析。熒光定量PCR 反應體系：SsoFastTMEvaGreen?Supermix 5 μL，上、下游引物各(10 μmol/L) 0.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補足至10 μL。PCR程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。試驗進行3次重復，采用2-ΔΔCT法對基因相對表達量進行計算，采用Origin 2021繪圖。

2 結果與分析

2.1 茶樹開花相關基因的鑒定及克隆

以模式植物擬南芥中開花相關基因的序列信息為參考，在茶樹基因組數據庫TPIA中利用Blast檢索功能獲得5個茶樹開花相關基因，并在基因編碼區設計特異性引物(表1)，對5個基因進行克隆，克隆到5個CsPEBP家族基因(圖 1)，其長度均在500 bp左右，分別命名為CsFT、CsATC、CsMFT、CsTFL1和CsBFT。分析結果顯示：CsTFL1、CsBFT、CsATC和CsMFT基因的核苷酸序列與TPIA數據庫中的序列一致， 但CsFT基因的克隆序列與TPIA數據庫序列相比缺失了42 bp的序列，可能是因為本研究克隆過程中采用的茶樹品種為‘南川大茶樹’，與TPIA數據中使用的‘舒茶早’茶樹品種不同所致。

M. DL2000; 1. CsTFL1; 2. CsFT; 3. CsMFT; 4. CsBFT; 5. CsATC圖1 茶樹開花相關基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of flowering-related genes in tea plant

2.2 茶樹開花相關基因的生物信息學分析

2.2.1 茶樹開花相關基因的基本信息茶樹開花相關基因的基本信息和蛋白質理化性質如表2所示，5個茶樹開花相關基因長度為519～525 bp，編碼氨基酸數目為172～174 aa，蛋白質的分子量在19.17～19.64 kD之間，等電點的范圍在7.74～8.93，均為堿性蛋白。蛋白質亞細胞定位預測顯示，CsATC、CsMFT、CsBFT定位于細胞質， CsFT定位于細胞核， CsTFL1定位于細胞核和細胞質。

表2 茶樹和擬南芥中開花相關基因的基本信息

2.2.2 茶樹開花相關基因蛋白的系統進化分析根據擬南芥、水稻、甜橙、葡萄、楊樹及茶樹PEBP家族成員的蛋白質序列，用 MEGA 4軟件構建系統進化樹。PEBP蛋白家族可分為MTF-like、FT-like和TFL1-like 3個亞家族，其中，MFT-like亞家族中有7個成員PEBP蛋白，包括茶樹、甜橙、葡萄、楊樹和擬南芥各1個，水稻2個；FT-like亞家族有24個PEBP蛋白，包括水稻13個，甜橙4個，楊樹4個，擬南芥2個和茶樹1個；TFL1-like亞家族有19個PEBP蛋白，其中擬南芥3個，茶樹3個，甜橙3個，楊樹3個，葡萄3個和水稻4個(圖2)。

Cs. 茶樹；Os. 水稻；orange. 甜橙；At. 擬南芥；VIVT. 葡萄；Potri. 楊樹圖2 茶樹與擬南芥等植物中開花相關蛋白的系統進化樹分析Cs. Tea plant； Os. Oryza sativa； Orange. Citrus sinensis； At. Arabidopsis； VIVT. Vitis vinifera； Potri. PoplarFig.2 Phylogeny of flowering-related proteins in tea plant and Arabidopsis et al

MTF-like亞家族中茶樹CsMFT與楊樹Potri.015G041000.1、葡萄VIVT01008404001聚為一支；FT-like亞家族中茶樹CsFT與楊樹Potri.008G077700.1、Potri.002G210200.1、Potri.010G179700.1、Potri.010G179900.1和甜橙Orange1.1g035892m聚到一支；TFL1-like亞家族中的CsATC與葡萄的VIVT01036145001，CsTFL1、CsBFT分別與甜橙的Orange1.1g035977m、Orange1.1g030703m聚到同一分支。綜上所述，茶樹中開花相關蛋白與楊樹、葡萄、甜橙等木本植物的親緣關系更近，可能具有相似的蛋白功能。

2.2.3 保守基序分析為進一步研究茶樹開花相關基因序列的特征，分析了5個茶樹開花相關基因的結構和保守基序組成。茶樹開花相關基因結構分析顯示(圖3)：此家族5個基因均由3個內含子和4個外顯子組成與擬南芥PEBP基因家族的基因結構相似，此家族基因外顯子長度相似但內含子長度差異較大；5個編碼茶樹開花相關蛋白與擬南芥均含有motif 1～5基序元件，元件順序一致，具有高度的保守性。但茶樹CsFT蛋白序列中多了motif 6和motif 7兩個基序元件，具有獨特的序列特征，推測其可能還具有其他特異性的結構功能。

圖3 茶樹開花相關基因的基因結構和保守基序Fig.3 The gene structure and conservative motif analysis of flowering-related genes in tea plant

2.2.4 基因的染色體定位與蛋白多序列對比茶樹開花相關基因進行染色體定位分析顯示(圖4)，5個茶樹開花相關基因分別定位于5條不同的染色體上，CsTFL1基因定位于1號染色體，CsFT基因定位于3號染色體，CsMFT基因定位于15號染色體，CsBFT基因定位于9號染色體，CsATC基因定位于7號染色體。5個茶樹開花相關基因編碼的蛋白的多序列比對結果發現(圖5)，5個蛋白的氨基酸序列存在高度相似性，其比對結果的一致性高達72.7%，推測其具有類似的功能，可能存在功能冗余。

圖4 茶樹開花相關基因的染色定位Fig.4 Chromosome location of flowering-related genes in tea plant

圖中方框為3個保守結構域D-P-D-x-P 、H和G-x-H-R圖5 茶樹開花相關蛋白的多序列比對The three conserved domains labeled in the figure were D-P-D-x-P, H and G-x-H-RFig.5 Multiple sequence alignment of flowering-related proteins in tea plant

2.2.5 茶樹開花相關基因家族編碼蛋白的結構分析對該蛋白家族的蛋白二級和三級結構進行分析發現，自由卷曲是該5個蛋白的主要組成成分，所占比例在39.88%～49.07%之間；其次是延長鏈和α螺旋，所占比例為23.15%～27.75%；β轉角在蛋白結構中所占的比例最低。三級結構預測結果顯示，茶樹CsBFT、CsATC、CsMFT與擬南芥AtMFT蛋白，CsTFL1與AtTFL1、AtBFT蛋白的三級結構均具有高度的相似性，推測其具有相似的生理調節功能； 此外，茶樹CsFT與AtFT蛋白三級結構有極大部分的相似性外，還有獨特的結構特征(圖6)，說明茶樹CsFT蛋白可能還具有其他的生物學功能。

圖6 茶樹開花相關蛋白的二、三級結構Fig.6 The secondary and tertiary structure of flowering-related proteins in tea plant

2.2.6 茶樹開花相關基因的啟動子元件分析為了解茶樹開花相關基因的作用機制，本研究分析了啟動子順式作用元件(圖7)，5個茶樹開花相關基因啟動子中均包含有光響應元件、激素響應元件(赤霉素、生長素、脫落酸、水楊酸、茉莉酸響應元件)、逆境脅迫響應元件(干旱脅迫響應元件、低溫響應元件、創傷響應元件、厭氧誘導相關元件，防御和應激反應的順式作用元件)，還有一些與分生組織表達相關的順式調控元件、參與細胞周期調控元件和參與胚乳表達的順式調節元件，其中光響應元件和激素響應元件最多。

圖7 茶樹開花相關基因啟動子的順式作用元件分析Fig.7 Cis-acting element analysis of the promoter for flowering-related genes in tea plant

2.3 茶樹開花相關基因的時空表達特異性分析

本研究從茶樹基因組TPIA數據庫下載了茶樹開花相關基因在不同組織的轉錄表達數據，分析其在生長發育過程中的功能。CsFT、CsATC、CsTFL、CsBFT基因在大部分組織中表達量都低，但CsMFT基因在茶樹各個部位表達量都高于其他4個基因，且在茶樹芽頭、嫩葉和莖的表達量較高(圖8)，由此推測基因CsMFT在茶樹開花調控中可能起主要的調控作用。

顏色代表log2值，紅色代表高表達，藍色代表低表達。下同圖8 茶樹開花相關基因的組織特異性表達分析The color represents the high (red) and low (blue) expression levels. The same as below.Fig.8 Tissue specific expression of flowering-related genes in tea plant

2.4 茶樹開花相關基因在非生物脅迫下的表達分析

為探究茶樹開花相關基因在非生物逆境脅迫下的響應機制，本研究還從茶樹基因組數據庫TPIA獲取茶樹開花相關基因在非生物脅迫下的轉錄表達數據并制成熱圖。結果表明(圖9)，在4種非生物脅迫下茶樹CsFT、CsATC、CsTFL1、CsBFT基因響應靈敏度均較低，而茶樹CsMFT基因有較高的表達。在茉莉酸甲酯(MeJA)處理條件下，CsMFT基因經外源激素茉莉酸甲酯處理后表達下調，且在處理24 h時表達量最低。在冷馴化處理條件下，茶樹CsMFT基因表達均受到抑制，CsFT基因表達量有少量上調。在干旱脅迫條件下，茶樹CsFT基因的表達量隨PEG處理時間的延長表現上調趨勢，而CsMFT基因的表達量受到抑制。在鹽脅迫下，CsFT基因表達量在NaCl處理72 h有輕微的上調，而CsMFT基因的表達受到抑制，且隨處理時間的增加抑制程度也增加。推測在茶樹開花相關基因中，CsMFT基因是主要參與非生物脅迫相應過程的基因。

CK、CA1、CA2分別代表未冷馴化處理、完全馴化和去馴化圖9 不同非生物脅迫處理下茶樹開花相關基因的表達CK, CA1 and CA2 mean non-cold domestication control, complete domestication and de-tamedFig.9 Expression analysis of flowering-related genes under different abiotic stresses in tea plant

2.5 茶樹開花相關基因花期表達分析

本研究采用熒光定量PCR法分析了基因在不同開放時期的茶樹花中表達情況，結果顯示(圖10)，CsFT、CsATC基因在整個開花期均呈現高表達，CsTFL1基因在整個開花期的表達量均較低。茶樹CsFT、CsATC、CsMFT基因的表達量均呈現相同水平，即在茶樹花半開時表達量達到最高，并且隨著茶樹花開放時間的推移表達量下降，花盛開時幾乎不表達。推測5個茶樹開花相關基因是在茶樹花半開時表達量高。

HB. 花苞；LB. 露白；BK. 半開；QK.全開；SK.盛開圖10 不同開花時期茶樹開花相關基因的表達HB. Bud stage； LB. Initial opening； BK. Half opening； QK. Full opening； SK. BloomingFig.10 Gene expression of flowering-related genes in different flowering periods of tea plant

2.6 CsMFT的可變剪切

在克隆CsMFT基因的過程中發現有2條帶(圖11)，條帶大小分別在500 bp與750 bp左右，推測此基因可能存在2個不同的轉錄本。對這兩條帶進行了測序和比對分析發現，CsMFT基因(525 bp)與茶樹基因組數據庫TPIA中CsMFT基因的序列基本一致，長度與下載序列信息相同，在75、97、416三個位點發生單堿基變異，但其編碼蛋白序列未發生變異。689 bp大小的CsMFT基因序列與下載序列信息相比，在581處存在一個單堿基變異(A→G)，在200 bp處多了一段164 bp的基因片段，此基因片段含有7個終止密碼子。經基因結構分析發現(圖12)，此增加的片段為第一、二外顯子之間的區域，并與前后2個外顯子合并形成1個外顯子，屬于內含子保留的剪切方式。

M．DL2000圖11 CsMFT基因的可變剪切Fig.11 Alternative splicing of CsMFT gene

圖12 CsMFT基因的可變剪切的結構比較Fig.12 Gene structure of alternative splicing of CsMFT gene

3 討 論

開花是植物從營養生長到生殖生長轉變的關鍵過程，PEBP家族基因參與了植物花器官形成和其他生長發育過程[31]。目前，已經有多種植物的PEBP基因被鑒定，茶樹PEBP基因家族有5個成員，除了CsFT比基因組組裝序列少了42 bp堿基序列外，其余4個基因與基因組TPIA數據庫中提供的核苷酸序列一致。CsPEBPs蛋白的空間結構、保守結構域等與擬南芥該家族蛋白類似，具有高度保守性，均含有D-P-D-x-P 基序、80位的his和G-x-H-R 基序等PEBP蛋白家族的特征保守結構[32]。FT與TFL1蛋白質序列高度相似，但功能相反，在其他植物中，決定其功能的關鍵位點在FT蛋白中是Tyr(Y85)，在TFL1蛋白中是His(H88)[33]，在茶樹中CsFT蛋白存在Tyr(Y84)，CsTFL1蛋白中存在His(H85)，因此，茶樹CsFT基因與CsTFL基因具有高度保守性，在茶樹進化過程中并未發生過多改變。另外，與已報道的擬南芥、辣椒、甘藍、棉花和月季等植物中的PEBP基因結構相同[34-37]，CsPEBPs基因也有4個外顯子和3個內含子。與已知其他植物相比，茶樹中該基因家族的成員數量較少，只有5個，可能是由于茶樹在進化過程中發生了基因的丟失，并且與同為木本植物的楊樹PEBP家族具有最近的親緣關系。

植物PEBP基因家族成員的基因表達具有組織表達特異性，同一亞家族基因表達模式相似。棉花GhMFT3D、GhMFT3A和GhFTL2A基因在花瓣或雄蕊中的表達量最高[38]；梨PbFT基因在葉片中表達量最高，其他基因在各個組織中表達量均較低[39]；小麥TaPEBP基因表達水平不同，在同一亞家族內，基因具有相似的表達模式[40]；茶樹CsPEBP基因家族成員也具有組織表達特異性，且CsMFT基因的表達量整體高于CsFT、CsTFL1、CsBFT、CsATC，CsMFT基因在茶樹生長中發揮主要調控作用。

關于植物PEBP基因家族的功能研究主要集中在植物開花調控和形態構建方面[41]。TFL1突變體被認為具有早開花和促進末端花分生組織形成的作用[42-43]；CEN(Centroradialis)基因在花序頂端表達，并與FLO(Floricaula)基因相互作用共同調控花的位置和形態發育[44]。FT基因除具有促進開花的作用外，還可參與植物營養生長和貯藏器官分化過程調控[13, 45]。在花的不同發育時期，茶樹CsFT基因的表達量均遠高于其他基因，且在半開和全開時期達到最高，冬棗FT基因在開花期較花苞期的表達量高[46]，說明CsFT基因的開花調控功能主要作用于花的半開和全開時期。茶樹花期的表達分析中CsMFT、CsFT和CsATC基因有相同表達模式，說明這3個基因可能存在部分功能相同，共同促進茶樹開花。此前，MFT基因被認為對種子萌發有促進作用，同時對促進植物開花也有一定作用[24-25]。本研究中CsMFT基因在芽頭、嫩葉的表達量高于花、果等，且該基因存在可變剪切現象。TFL1基因被認為對植物開花起抑制作用[10]，CsTFL1在花期表達分子中幾乎無表達，與其功能預測相符合。PEBP基因家族還可參與植物非生物脅迫的響應過程，但這方面的研究較少。小麥TaPEBP基因的表達對冷、熱、干旱、白粉病、條銹病、麥瘟病等非生物脅迫均有響應[47]；青杄PwPEBP在干旱、低溫和高溫下均有明顯響應，對鹽脅迫響應較低[48]；茶樹5個CsPEBP基因的表達也受到非生物脅迫的影響，其中，CsMFT基因受到鹽、干旱、冷及MeJA等非生物逆境的誘導，基因表達水平高，而CsFT、CsTFL1、CsBFT、CsATC基因的表達水平較低。絕大多數植物PEBP基因的啟動子都包含光響應元件。蘋果MdPEBP基因家族含有較多的光響應元件和激素響應元件[49]；光響應元件在棉花GhPEBP家族基因啟動子區域普遍存在[50]；茶樹CsPEBP基因家族啟動子含有較多的光響應元件與激素響應元件，均表明其功能與光調控和激素調節的關聯性較強。

可變剪切廣泛存在于各種植物轉錄過程中，是增加基因表達調控方式的重要途徑之一，有利于植物生長和環境適應[28]。內含子保留(IR)出現在植物中頻率遠高于動物，一些研究認為IR現象的發生是因為不準確的剪切信號影響剪切效率，在另外的研究中IR也被證實可通過外部刺激觸發作用于特定發育階段和組織類型，并呈現性別二態性[51-52]。本研究發現茶樹CsMFT基因存在可變剪切的現象，第一、二外顯子之間的內含子部分未被剪切，屬于內含子保留(IR)。其中，長度為689 bp的轉錄本并不是完整的開放閱讀框(ORF)，在位點285提前終止翻譯，不能夠形成完整的CsMFT蛋白，而長度為525 bp的轉錄本可以表達成完整的CsMFT蛋白，該現象的存在在茶樹開花調控可能起到開關的作用，本課題組將會繼續深入研究茶樹中存在該機制的生物學意義。

綜上所述，本研究克隆了5個茶樹CsPEBP家族基因，并利用生物信息學的方法全面分析了其編碼蛋白的結構特點、組織表達特性及其啟動子元件等信息，用熒光定量PCR的方法分析了CsPEBPs開花過程中的表達特異性。此外，茶樹CsMFT基因存在可變剪切，存在兩個不同長度的轉錄本。本研究結果可為茶樹開花調控的機理研究提供新思路。