青稞HvnRPS2基因克隆及其在條紋病脅迫下的表達分析

魏 嬋，姚曉華，姚有華，安立昆，陳 林，吳昆侖

(青海大學，青海省農林科學院，青海省青稞遺傳育種重點實驗室，國家麥類改良中心青海青稞分中心，西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f.)屬禾本科小麥族大麥屬，為普通大麥的種內變種，是青藏高原上的優勢特色農作物[1]。青稞種植產地分布比較廣泛，在中國主要分布在西藏、青海，以及四川的甘孜州和阿壩州、云南的迪慶、甘肅的甘南等地，可在青藏高寒高海拔地區正常成熟[2-3]。青稞因獨特的醫藥保健、釀酒、糧食和飼料的作用，人們對青稞的需求急劇上升[4-5]。條紋病是由種子攜帶麥類核腔菌(Pyrenophoragraminea)引起的系統侵染性種傳病害[6-8]。大麥條紋病害在世界上不同大麥種植區普遍發生，中國以長江流域發病較為普遍[9-11]。2012年青海省內青稞條紋病發生面積約5.2萬hm2，嚴重威脅青稞的豐產穩產[12]。目前主要防治方法是播種前藥劑拌種[13]，但青藏高原生態環境非常脆弱，嚴控農藥化肥，抗病品種選育是最有效、最環保的方式。目前抗條紋病基因篩選的研究相對較少，國外學者利用抗和不抗條紋病的大麥品種雜交后代進行定量性狀位點(QTL)分析，定位出2個與抗病相關的基因Rdg1a和Rdg2a，過量表達這2個基因能夠顯著提高大麥對條紋病菌株的抗性[14-15]。另有學者利用傳統分群分析法(bulksegregant analysis,BSA)定位出抗病基因Rdg3[16]。姚曉華等[17]通過轉錄組測序(RNA-seq)獲得一個條紋病脅迫下差異表達的AGO1基因，發現該基因受條紋病脅迫的誘導；楊雪等[18]克隆獲得一個青稞抗條紋病基因HvtRGA，發現該基因受條紋病脅迫誘導表達，且抗病品種‘昆侖14號’感病后基因表達量顯著高于感病品種‘Z1141’。近年來隨著全球氣候的變化，青稞種植區降雨量增多，條紋病頻發，因此進一步分析、鑒定新的青稞抗條紋病基因非常必要。

目前抗病R蛋白大多數屬于NBS-LRR類R蛋白，主要具有NBS(nucleotide-binding site)和LRR(leucine-rich repeat)結構域[19]。NB-ARC屬于NBS-LRR類蛋白中的一個大家族，具有高度保守的NB-ARC結構域，可以通過結合ADP或ATP來參與植物抗病蛋白的構象變化，進而激活植物免疫響應與病原菌識別[20]。RPS2是典型的NB-ARC類抗病基因，在擬南芥中研究較多。例如：擬南芥的RPS2具有NBS和LRR結構域，在擬南芥的抗細菌性病害(Pseudomonassyringae)中發揮重要作用[21]；HSP90與RAR1和SGT1相互作用，對擬南芥中RPS2介導的抗病性至關重要[22]；RPS2基因對攜帶avrRpt2基因的細菌病原體具有抗性[23]。另外，在東鄉野生稻中，利用NBS保守結構域獲得的探針及基于RecA文庫富集方法篩選并克隆了RPS2基因[24]。在粳稻的全基因組測序結果中也發現有類似RPS2的基因[25]。Zeng等[26]利用全基因組測序的方法獲得了青稞HvnRPS2基因的蛋白序列，但尚未見核苷酸序列和其在抗病方面的研究報道。

本研究通過分析不同抗性青稞品種條紋病感染后正常葉片和感病葉片的RNA-seq結果，經過比較鑒定出一個差異表達的HvnRPS2基因。在抗病青稞品種‘昆侖14號’和感病青稞品種‘Z1141’ 中克隆了該基因，并利用生物信息學軟件對其序列信息、理化特性及與其他物種的進化關系進行了分析，推測了其可能功能。同時利用實時熒光定量(qRT-PCR)技術分析了在條紋病脅迫下，HvnRPS2基因在不同抗病性青稞品種和不同感病時期的表達模式。研究結果為進一步分析HvnRPS2基因在青稞抗條紋病中的功能及其抗病機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

青稞抗病品種‘昆侖14號’和感病品種‘Z1141’均由青海大學農林科學院作物栽培與育種研究所青稞研究室繁育保存提供。

1.2 方 法

1.2.1 青稞葉片總RNA的提取及cDNA合成對青稞抗條紋病品種‘昆侖14號’和感病品種‘Z1141’用條紋病原菌種侵染后，利用TaKaRa寶日醫生物技術(北京)有限公司的RNA提取試劑盒，分別于感染后10、20、30、40和50 d提取正常葉片和感病葉片總RNA，測定RNA的濃度和純度，并將RNA濃度稀釋成一致，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。并參照TaKaRa寶日醫生物技術(北京)有限公司的cDNA合成試劑盒(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)反轉錄成cDNA模板，-20 ℃保存備用。

1.2.2 青稞HvnRPS2基因的克隆用條紋病原菌侵染青稞抗條紋病品種‘昆侖14號’和感病品種‘Z1141’[27]，經轉錄組測序后，選取1個差異表達的RPS2基因(Gene ID: HORVU2Hr1G089020)。利用Primer primer 5.0設計RPS2基因(Gene ID: HORVU2Hr1G089020)的全長引物(表1)。以‘昆侖14號’和‘Z1141’的葉片cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系參照姚曉華等[17]的方法。利用柱式凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)回收目的條帶，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產物的質量。用超微量核酸蛋白測量儀(Nano Photometer)測定回收產物的濃度和純度，取3 μL回收產物并將其連接到pEasy-Blunt載體(全式金生物)上，再轉化至大腸桿菌Trans-T1感受態細胞，放置37 ℃恒溫培養箱12～16 h，利用藍白斑篩選隨機挑取10個單克隆菌落至含Kan+抗性的LB液體培養基培養3～4 h，使用通用引物M13F/R對3個陽性克隆單菌落進行菌液PCR鑒定篩選，送至上海生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.3 青稞HvnRPS2基因生物信息學分析利用Protparma(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)和Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析該蛋白的理化性質和親/疏水性；利用SignalP 4.1(http://www.Detaibio.com/tools/signal-peptide.html)和TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/)分析目的蛋白是否存在信號肽和跨膜結構；利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)軟件，對HvnRPS2蛋白分別進行結構域分析、二級結構和三級結構預測；利用NCBI中Blastp功能，查詢與HvnRPS2蛋白同源的其他9個禾本科物種RPS2蛋白序列，利用DNAMAN6.0軟件進行多序列比對和一致性分析[17]。

從大麥參考基因組(ftp://ftp.gramene.org/pub/gramene/release-36/fasta/hordeum_vulgare/dna/)調取與HvnRPS2進化關系較近的6個大麥NB-ARC類基因(Gene ID: HORVU0Hr1G008580、HORVU2Hr1G089020、HORVU5Hr1G113500、HORVU7Hr1G055680、HORVU2Hr1G064140和HORVU3Hr1G077670)，從水稻參考基因組(http://rice.plantbiology.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotation_dbs/pseudomolecules/version_7.0/all.dir/all.con)調取6個水稻NB-ARC類基因(Gene ID: LOC_Os09g10054、LOC_Os09g14060、LOC_Os09g14100、LOC_Os04g1401039460、LOC_Os01g57870和LOC_Os03g14900)，從擬南芥參考基因組(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-43/fasta/arabidopsis_thaliana/dna/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.gz)調取3個擬南芥NB-ARC類基因(Gene ID: AT1G15890、AT3G15700和AT4G27220)和從玉米參考基因組(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-43/fasta/zea_mays/dna/Zea_mays.B73_RefGen_v4.dna.toplevel.fa.gz)調取2個玉米NB-ARC類基因(Gene ID: Zm00001d003048和Zm00001d043233)，根據它們編碼的氨基酸序列，利用Mega 7.0軟件及ITOL(https://itol.embl.de)構建系統進化樹。

1.2.4HvnRPS2在青稞條紋病脅迫下的表達量分析采用Primer 5.0設計擴增獲得的HvnRPS2基因的qRT-PCR引物，以條紋病侵染10、20、30、40和50 d的‘昆侖14號’和‘Z1141’正常葉片和感病葉片的cDNA(200 ng·μL-1)為模板，以18SrRNA為內參進行qRT-PCR，引物序列見表1。反應體系為20 μL，其中TB Green premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X)10 μL，cDNA模板2 μL，PCR上/下游引物(10μmol·L-1)各0.8 μL和ddH2O 6.4 μL。qRT-PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次；溶解曲線，95 ℃ 5 s，70 ℃ 1 min，實驗結果應用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量[28]。每個樣品設3個生物學重復和3個技術重復，利用SPSS22.0進行顯著性檢測。

表1 引物信息

2 結果與分析

2.1 青稞HvnRPS2基因的克隆與序列分析

以青稞抗病品種‘昆侖14號’和感病品種‘Z1141’的葉片cDNA為模板，以HvnRPS2-F/R為引物，經PCR擴增獲得一條約3 000 bp的目的條帶(圖1)。測序結果表明，其完整開放閱讀框為2 760 bp，編碼919個氨基酸。序列比對結果顯示，來自‘昆侖14號’和‘Z1141’的堿基序列和編碼的氨基酸序列均100%一致。利用NCBI在線工具對其序列進行保守結構域預測，發現該基因具有典型的NB-ARC和LRR結構域。

M. DL5000；1. 昆侖14號；2. Z1141；M. DL5000; 1. Kunlun 14; 2. Z1141圖1 HvnRPS2基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of HvnRPS2

蛋白質理化性質分析表明，HvnRPS2蛋白分子式為C4628H7417N125901378S47，分子量為104.2 kD，不穩定指數為45.85，脂溶指數是101.64，理論等電點為5.95，是個親水性的不穩定酸性蛋白，不存在跨膜結構，且無信號肽。該蛋白的二級結構主要由無規卷曲(58.11%)和α-螺旋(29.92%)組成，其中無規卷曲占，α-螺旋，這兩個二級結構在蛋白行使功能時可能發揮重要作用(圖2)。三維結構預測，由圖3可知，HvnRPS2蛋白的功能結構域折疊成祥龍狀，N端包含了NB-ARC特征結構域；C端主要包含LRR特征結構域。Unipro(https://www.uniprot.org/)基因注釋結果表明該蛋白為RPS2，因此將該基因命名為HvnRPS2。

藍色. α-螺旋；紅色. 延伸鏈；綠色. β轉角；橙色. 無規則卷曲圖2 HvnRPS2蛋白二級結構預測Blue. α-helix; Red. Extended chain; Green. β-turn; Orange. Random coilFig.2 Secondary structure prediction of HvnRPS2

圖3 HvnRPS2蛋白三級結構預測Fig.3 Teritary structure prediction of HvnRPS2

2.2 HvnRPS2蛋白的同源比較及系統進化分析

采用DNAMAN 6.0進行氨基酸序列比對，結果發現，青稞HvnRPS2蛋白與大麥、山羊草、二穗短柄草等10個禾本科植物的蛋白序列相似性為75.58%，其中與大麥、二穗短柄草、小麥、山羊草的RPS2氨基酸序列相似性較高，分別為99.89%、94.57%、94.56%和94.36%，且這些序列都具有高度保守的NB-ARC、ATPase-2、LRR和LRR-8結構域(圖4)，其中NB-ARC、LRR和LRR-8結構域在上述禾本科植物種的相似性分別為85.16%，92.73%和91.97%。可見，10個RPS2蛋白雖然相似性不太高，但3個結構域相似性均大于85%，推測這3個保守的結構域在HvnRPS2蛋白的功能發揮中起重要作用。

從大麥、擬南芥、水稻(日本晴)和玉米的參考基因組中調取與青稞HvnRPS2基因進化關系相近的17個NB-ARC家族基因，利用它們編碼的氨基酸序列構建系統進化樹。由圖5可知，18個NB-ARC基因家族成員根據R基因編碼的蛋白被劃分為5類，其中HvnRPS2與大麥和水稻的NB-ARC類蛋白在同一分支，推測它們具有類似的功能。

HORVU. 大麥；AT. 擬南芥；Zm. 玉米；LOC. 日本晴；粉色區域代表親緣關系最近圖5 HvnRPS2蛋白與其他NB-ARC類基因系統進化分析HORVU. Hordeum vulgare; AT. Arabidopsis thaliana; Zm. Zea mays; LOC. Oryza sativa subsp. japonica. cv. nipponbare； The pink area represents the closest kinshipFig.5 Phylogenetic tree analysis of the HvnRPS2 and NB-ARC in other plants

2.3 HvnRPS2在條紋病脅迫下的表達

以正常葉片為對照，以18SrRNA為內參基因，對HvnRPS2基因的表達模式進行qRT-PCR分析。由圖6可知，條紋病病原菌侵染10～20 d，HvnRPS2基因表達量顯著下降，其中‘昆侖14號’正常葉片下降47.79%，感病葉片下降89.52%；‘Z1141’正常葉片下降38.67%，感病葉片下降78.51%；‘昆侖14號’下降值顯著高于‘Z1141’。侵染20～40 d，HvnRPS2基因表達量顯著上調，并在40 d達到最高值，其中‘昆侖14號’正常葉片升高1.52倍，感病葉片升高2.69倍；‘Z1141’正常葉片升高1.63倍，感病葉片升高2.81倍；且‘Z1141’升高值高于‘昆侖14號’。侵染40～50 d，HvnRPS2基因表達量顯著下降，其中‘昆侖14號’正常葉片下降31.77%，感病葉片下降95.53%；‘Z1141’正常葉片下降28.6%，感病葉片下降86.15%；且‘昆侖14號’下降值顯著高于‘Z1141’。為進一步分析不同抗性品種的HvnRPS2基因在條紋病侵染下的響應模式，對表達量進行多項式曲線擬合。結果表明，隨著條紋病脅迫時間的延長，HvnRPS2基因在不同抗性品種中的表達量均呈現先下降后上升而后下降的變化趨勢，與正常葉片相比，感病葉片的HvnRPS2基因表達量極顯著下調，且抗病品種的表達量下調值顯著高于感病品種(P<0.01)。推測HvnRPS2在青稞抗條紋病過程中發揮重要的負調控作用。

KL14-CK.‘昆侖14號’正常葉片；KL14-T.‘昆侖14號’感病葉片；Z1141-CK. ‘Z1141’正常葉片；Z1141-T. ‘Z1141’感病葉片；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)圖6 不同抗性品種HvnRPS2基因在條紋病脅迫下的表達模式KL14-CK. The normal leaves of ‘Kunlun 14’; KL14-T. The susceptible leaves of ‘Kunlun 14’; Z1141-CK. The normal leaves of ‘Z1141’; Z1141-T. The susceptible leaves of ‘Z1141’; Different capital letters indicate differences at 0.01 levelFig.6 Expression pattern of HvnRPS2 gene in different resistant Tibetan hulless barley varieties infection with leaf stripe disease

3 討 論

本實驗克隆的HvRPS2基因的氨基酸序列與Zeng等[26]公布的西藏青稞基因組中HvnRPS2氨基酸序列相似性高達100%，但并未公布其核苷酸序列；在NCBI中，與大麥HvRPS2氨基酸序列相似性高達99.89%，驗證了本實驗克隆的基因即為青稞HvnRPS2。研究表明，RPS蛋白包含高度保守的結構域，如NBS、LRR、LRR-8和P-loop，這些結構域通過結合ADP或ATP來調節植物抗病蛋白的構象變化，從而調節下游抗病信號的傳導[29]。本研究結果顯示，HvnRPS2蛋白具有典型的NBS保守結構域和LRR結構域。LRR可以通過參與蛋白質之間的互作并結合病原體衍生出來的分子來識別病原菌[30]，LRR區域的突變能夠改變植物的抗性[31]。陶易等[32]對擬南芥RPS2基因NBS和LRR部位的突變進行了分析，發現LRR結構域參與信號感知，蛋白質的N末端部分，包括N末端疏水結構域、NBS和其他保守結構域，在信號轉導中起作用。推測HvnRPS2的NBS和LRR結構域在青稞抗條紋病過程發揮重要的功能。

與不同物種NB-ARC類基因的進化分析表明，青稞HvnRPS2基因與水稻LOC_Os09g14060基因和大麥HORVU2Hr1G089020基因聚為一支。前人在水稻抗稻曲病遺傳機制的研究中，利用抗性品種RYT2668和高感品種PR116雜交獲得的重組自交系進行QTL定位，分別在水稻2、4、5、7、9染色體上定位了7個QTL，位于9號染色體的主效QTL qRFSr9.1包含116個ORF，其中聚為一類的3個抗病基因 (Gene ID: LOC_Os09g14010、LOC_Os09g14060和LOC_Os09g14100)，被注釋為RPS2型抗病蛋白[33]。大麥HORVU2Hr1G089020在Phytozome上被注釋為編碼抗病蛋白RPS2，包含NBS保守結構域和LRR結構域，但目前未見相關功能的報道。因此推測HvnRPS2基因可能在青稞抗條紋病中發揮作用，但其作用機制有待進一步研究。

研究表明，擬南芥的RPS2基因在水稻中過表達后，對真菌病原體稻瘟病菌和細菌病原體水稻白葉枯病菌產生正響應[34]。而本研究中，條紋病脅迫下HvnRPS2基因則被抑制表達，且在抗病品種中的下調值顯著高于感病品種，這種不同可能跟病原菌侵染時間、病原菌類型及上下游調控的基因有關。一些抗病相關基因在病原菌入侵時會被抑制表達，起到負調控的作用，如SGT1和SRFR1通過免疫共沉淀相互作用，共同負調節R蛋白的積累，以防止免疫反應的自動激活[35]；RPS2表達活性受NBS-LRR結構域及基序調控，從而直接或間接調控植物的抗病性，N末端的突變導致蛋白質對擬南芥RPS2產生負面影響，擬南芥RPS2與AvrRpt2介導RIN4之間存在負反饋調節，RPS2的防御通路在激活過程中通過消除RIN4而感知抗病啟動信號產生抗病性[36-37]。HvnRPS2基因對條紋病的這種負響應模式可能是調控了下游的R基因，從而直接或間接調控青稞的抗病性，但其機制有待進一步研究。另有研究表明，植物遭受逆境時，體內某些抗逆生理指標和基因往往會出現先降低后升高再降低應激反應[38-40]。某些抗逆基因在抵抗非生物逆境脅迫時具有功能冗余性，在對小麥抗逆基因TaSnRK2.9的抗逆功能研究中發現，在ABA誘導后的6 h，該基因的表達量呈現先降低后升高再降低的趨勢水平，推測TaSnRK2.9參與了ABA介導的信號調控，因其負反饋調控導致TaSnRK2.9基因表達的短暫下降，最終則達到一個平衡狀態[41-42]。當尖孢鐮孢菌侵染油桐幼苗根系時，油桐3個NPR1類基因的表達都被顯著抑制，其中VfNRP3在侵染后被完全抑制表達，VfNPR1和VfNRP5在侵染中后期稍有恢復，但都未能達到野生型的表達。本研究發現在條紋病脅迫下，HvnRPS2基因表達模式與抗性基因VfNPR1和VfNRP5的表達模式相似[43]。可見HvnRPS2基因是一個條紋病的負調控基因，今后我們可以利用基因敲除、基因編輯等方法將該基因從基因組中敲除，從而提高青稞的抗病性。本結果為研究HvnRPS2基因在青稞抗條紋病中的作用和調控機理奠定基礎。

本研究從‘昆侖14號’和‘Z1141’青稞品種克隆的HvnRPS2，具有高度保守的NB-ARC和LRR結構域，屬于青稞NBS-LRR類進化分支中的NB-ARC家族成員。其在青稞條紋病侵染后的表達模式表明，與正常葉片相比，感病葉片的HvnRPS2基因表達量極顯著下調，且抗病品種基因表達量下調值顯著高于感病品種，推測HvnRPS2在青稞抗條紋病調控過程中發揮重要的負調控作用。