桃兒七種子低溫層積過程中胚形態及生理生化物質變化

久西加，杜 弢,2*，陳紅剛,2，李 飛，徐寵然

(1 甘肅中醫藥大學和政藥用植物園，甘肅和政 731200；2 西北中藏藥協同創新中心，蘭州 730000)

桃兒七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying]為小檗科(Berberidaceae)桃兒七屬(SinopodophyllumYing)多年生草本植物，其果實及根莖均能入藥，具有調經活血的作用[1]。藥理學研究表明桃兒七中含有的鬼臼毒素及其衍生物具有明顯的抗腫瘤活性，且鬼臼毒素衍生物依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)已在臨床上被廣泛應用[2-3]。但是由于桃兒七種子所具有的休眠特性及市場需求的進一步增加導致其野生資源匱乏，目前已被列為國家二級保護植物[4-5]。

層積過程中種胚形態的建成和生理生化的變化是種子休眠解除的重要原因。低溫層積促進種胚發育從而解除種子休眠，這在銀杏[6]、山茱萸[7]等植物上已有印證，王蕾等[8]研究發現大花貝母經層積后其種胚也從點狀胚逐步發育至線型胚，從而完成休眠的解除。而層積過程中種子內營養物質及酶活性的變化又在另一層面上影響著種子的休眠狀態，如榧樹種子中淀粉、粗脂肪含量隨休眠解除而下降[9]，滇重樓種子在休眠解除過程中其淀粉、可溶性蛋白含量也呈下降趨勢[10]。其次，呼吸途徑的轉變也是種子休眠解除的關鍵[11-12],PK、SDH、G-6-PDH作為EMP途徑、TCA途徑、PPP途徑的關鍵限速酶，一定程度上反映著相應呼吸途徑的活化水平[13]，如西洋參種胚后熟過程中,其G-6-PDH酶活性逐漸升高,PPP途徑的活化導致休眠的解除[14]。另外，內源激素可對植物內部的多個生理生化過程產生影響[15]，ABA促進種子貯藏蛋白和脂肪的合成,促進種子脫水耐性和種子休眠的獲得,抑制種胚萌發;GA促進α-淀粉酶、核酸酶、蛋白水解酶、ATP酶等的表達,解除種子休眠,促進萌發[16-17]；而IAA可能通過間接調控GA和ABA生物合成與信號轉導途徑從而對種子的休眠與萌發產生作用[18-19]。

桃兒七種子所具有的休眠特性是導致其資源匱乏的主要原因，栗孟飛[20]研究表明桃兒七種子內含有的內源抑制物是導致其休眠產生的主要原因。而李城德等[21]的研究表明種皮和胚乳的限制以及生理后熟導致桃兒七種子休眠。雖然用GA3溶液浸種或低溫層積均能一定程度上解除桃兒七種子休眠,但目前對于桃兒七種子層積過程中胚形態及生理生化物質動態變化的研究鮮見報道。因此，本研究通過對桃兒七種子進行低溫層積處理，測定不同層積時間的種子胚形態及生理生化物質的動態變化，旨在探究桃兒七種子休眠解除與胚形態及生理生化物質之間的內在聯系，為揭示桃兒七休眠機理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

桃兒七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying]種子于2020年9月采于甘肅中醫藥大學和政藥用植物園(35°15′48″N，103°24′21″E)，并由甘肅中醫藥大學杜弢教授鑒定確認，先經清水浸泡，揉搓后去掉果肉，再過篩剔除癟粒，自然陰干，置于4 ℃冰箱儲存備用。

1.2 種子低溫層積處理

將河沙洗凈過篩(40目)，高壓滅菌鍋滅菌(121 ℃，30 min)，鋪至距容器底部3～4 cm處，將桃兒七種子裝入紗布網袋平鋪于河沙之上，再蓋河沙至距容器底部6～8 cm處，保證種子處于容器中部，沙子濕度為9%～11%，用保鮮膜封住容器，打孔透氣，將容器置于4 ℃冰箱中。以后每隔15 d定期取樣，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 種子胚形態及胚率觀測

從各層積時期種子中分別隨機選取15粒，蒸餾水浸泡16 h，OCT膠水常溫包埋10 min，冷凍包埋5 min(-20 ℃)，Leica-CM1950型恒冷切片機切片(厚0.15 mm)，先用1%番紅溶液染色3 min，再用0.1%固綠醇溶液染色30 s，LeicaDM500顯微鏡觀察種子形態結構，測量胚長和種子長，并用如下公式計算胚率：

胚率(%)=(胚長/種子長)×100%

1.4 種子生理生化指標測定

桃兒七種子淀粉含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、丙酮酸激酶(PK)活性、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性均采用試劑盒(南京建成)測定，具體操作按試劑盒說明進行。6-磷酸-葡萄糖脫氫酶(G-6-PDH)活性、赤霉素(GA)含量、吲哚乙酸(IAA)含量、脫落酸(ABA)含量均采用ELISA酶聯免疫法試劑盒(上海欽誠)測定，具體操作按試劑盒說明進行。

1.5 種子發芽率測定

隨機選取各層積時期桃兒七種子150粒，用1%的NaClO消毒15 min，蒸餾水沖洗3～5次，播于沙床上(鋪沙3～5 mm),每皿播種50粒，3次重復，在25 ℃全光照條件下培養，每天加水(1 mL)，記錄萌發種子數(以胚根突破種皮為種子萌發標準)，用如下公式計算發芽率：

發芽率(%)=(發芽種子數/供試種子總數)×100%

1.6 數據分析

使用Origin2019作圖, SPSS17.0進行方差及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 低溫層積過程中桃兒七種子胚形態、胚率及發芽率變化特征

桃兒七種子胚形態在低溫層積各時期均為魚雷型胚或子葉型胚(圖1)；桃兒七種子胚率在整個層積過程中總體呈上升趨勢，且胚率在層積75 ～90 d期間增長迅速，并在層積90 d時達到最大值(34.44%)(圖2，A)；桃兒七種子發芽率隨著低溫層積時間的延長總體呈上升趨勢，在層積60 d后休眠開始解除，種子發芽率顯著上升(P<0.05)，且在層積75 d時達到最大值(43.33%)(圖2，B)。

A.魚雷型胚；B.子葉型胚 圖1 桃兒七種胚形態A. Torpedo embryo; B. Cotyledon embryoFig.1 Embryo morphology of Sinopodophyllum hexandrum

不同小寫字母表示處理時間之間在0.05水平差異顯著(P<0.05)；下同圖2 不同層積時期桃兒七種子胚率及發芽率變化Different lowercase letters indicate that there are significant differences between treatment time points at 0.05 level (P<0.05)； The same as belowFig.2 Changes of embryo rate and germination rate of S. hexandrum seeds in different stratification periods

2.2 低溫層積過程中桃兒七種子營養物質含量的變化特征

由圖3可知，在低溫層積過程中，桃兒七種子內淀粉含量總體呈現下降趨勢，且在層積75～90 d期間下降最為迅速，層積90 d時的桃兒七種子內淀粉含量(2.08 mg/g)較處理前(47.89 mg/g)顯著下降95.66%(P<0.05)；種子可溶性蛋白含量在層積前期(0～30 d)變化平緩，在層積30～60 d期間出現小幅的波動，在層積60 d后顯著升高(P<0.05)，并在層積75 d達到最大值(69.26 mg/g)；種子可溶性糖含量在層積前期(0～30 d)顯著下降(P<0.05)，并在30 d時達到最小值95.39 mg/g，此后平緩上升，至層積90 d時，其含量與初始含量基本持平。

圖3 桃兒七種子層積過程中營養物質含量變化Fig.3 Changes of nutrient contents in seeds of S. hexandrum during seed stratification

2.3 低溫層積過程中桃兒七種子呼吸途徑關鍵酶活性變化特征

桃兒七種子呼吸途徑關鍵酶丙酮酸激酶(PK)活性在整個層積過程中呈現持續下降趨勢，在層積0～15 d活性下降顯著(P<0.05)，此后變化平緩，并在層積90 d時降到最小值1.85 U/g(圖4，A)；種子琥珀酸脫氫酶(SDH)活性在層積過程中總體呈下降趨勢，并分別在層積30～45 d和60～75 d期間下降顯著(P<0.05)(圖4，B)；在整個層積過程中，種子6-磷酸-葡萄糖脫氫酶(G-6-PDH)活性在54.58～87.51 U/g范圍內浮動且變化平緩，但在層積60～75 d之間活性顯著升高(P<0.05)，而后又迅速下降至初始水平(圖4，C)。

圖4 桃兒七種子層積過程中呼吸途徑關鍵酶活性變化Fig.4 Changes of key enzyme activities in respiratory pathway of S. hexandrum seeds during seed stratification

2.4 低溫層積過程中桃兒七種子內源激素含量變化特征

桃兒七種子GA含量在低溫層積前期(0～30 d)變化平緩且無顯著差異(P<0.05)；在層積60～90 d期間，其含量迅速上升并達到最大值431.97 ng/g(圖5，A)；種子IAA含量在整個層積過程中呈現階梯式增長趨勢，于層積0～15 d變化平穩，在層積15 d后迅速上升，且與前一時期差異顯著(P<0.05)，此后小幅上升但無顯著變化，至90 d時達到最大值108.76 ng/g(圖5，A)；種子ABA含量在整個層積過程中變化幅度較小且差異不顯著(P<0.05)，其含量在566.96～633.93 ng/g范圍內小幅波動(圖5，A)。另外，在低溫層積過程中，桃兒七種子各內源激素含量間比值均呈波動上升趨勢，并始終表現為GA+IAA/ABA最大，GA/ABA次之，IAA/ABA明顯小于前兩者，且變幅較小(圖5，B)。

圖5 桃兒七種子層積過程中內源激素含量及其比值的變化Fig.5 Changes of endogenous hormone contents and their ratios in seeds of S. hexandrum during stratification

2.5 桃兒七種子各指標間相關性分析

由表1可知，在桃兒七種子低溫層積過程中，種子胚率和發芽率與其營養物質含量、呼吸途徑關鍵酶活性、內源激素含量的18個相關系數中，數值絕對值達到0.5以上的有9個。其中，種子胚率與淀粉含量呈顯著負相關關系(r=-0.785*)，但與其余指標相關關系均不顯著(P>0.05)；發芽率與可溶性蛋白含量呈顯著正相關關系(r=0.867*)，但與其余指標相關關系均不顯著(P>0.05)。

表1 不同層積時期各指標間的相關性分析

3 討 論

3.1 桃兒七種子休眠解除與種胚形態的關系

根據Baskin[22]對種子休眠的分類，種胚形態結構尚未分化或未發育完全被稱為形態休眠。研究表明滇重樓種子成熟時胚發育不完整，存在形態休眠[23]。王晶等[24]研究發現朝鮮淫羊藿種子需經歷形態后熟才能萌發。本研究結果表明桃兒七種胚雖然在層積過程中不斷伸長發育，但均為魚雷型胚或子葉型胚，胚形態成熟，不存在形態休眠。這與陳偉等[25]的研究結果一致。

3.2 桃兒七種子休眠解除與營養物質轉化及呼吸代謝的關系

成熟種子內的淀粉在相關代謝酶的催化下逐步水解為可被利用的小分子物質，從而促進種子休眠的解除[26]，而種子中可溶性蛋白的含量間接反映著代謝活動的強弱，并為種子萌發提供充足的氮源，可溶性糖作為呼吸代謝的直接底物是種子中最直接的供能物質[27]。研究表明七葉樹種子在層積過程中脂肪和淀粉的含量持續下降，可溶性蛋白質含量逐漸升高，從而導致休眠解除[28]；黃精種子在低溫層積過程中其淀粉和粗脂肪逐步分解為可溶性糖及可溶性蛋白等小分子物質，為種胚的分化發育提供能量，從而促進黃精種子萌發[29]。本研究結果表明在低溫層積過程中桃兒七種子內淀粉含量持續下降，可溶性蛋白含量逐漸升高，且可溶性蛋白含量與發芽率呈顯著正相關(P<0.05)，說明桃兒七種子內淀粉可能通過淀粉酶的催化而進一步分解為葡萄糖等物質以用于供能；同時，種子可溶性糖含量在層積前期(0～30 d)出現顯著下降(P<0.05)，可能是種子從休眠狀態進入吸脹萌動階段時，首先將胚部或胚軸中少量的可溶性糖分解用于生長的結果，而可溶性糖在層積后期的逐步升高可能與淀粉的持續分解有關。這與張成才等[30]對百蕊草種子研究結果一致。另外，桃兒七種子內可溶性蛋白在層積前期基本沒有變化，但隨著層積的不斷進行，其含量出現顯著上升(P<0.05)，這可能是層積后期種子完成生理后熟的過程中，種子內部生理代謝增強的原因。

氧化途徑學說認為,種子休眠主要是受呼吸途徑中的糖酵解途徑(EMP)、三羧酸循環途徑(TCA)和戊糖磷酸途徑 (PPP) 的平衡調節[14]。楊艷華[31]對南京椴種子的研究表明，其胚乳內TCA途徑關鍵酶MDH及PPP途徑關鍵酶G-6-PD活性隨休眠解除而呈上升趨勢，并由此認為TCA和PPP途徑的活化是種子休眠解除的關鍵。圓齒野鴉椿種子在低溫層積過程中G-6-PDH和6-PGDH聯合酶活性波動上升，PPP途徑所占比例逐步升高，最終導致種子休眠解除[32]。本研究結果表明層積前后EMP途徑關鍵限速酶PK活性及TCA途徑關鍵限速酶SDH活性顯著降低(P<0.05)，PPP途徑關鍵酶G-6-PDH活性在層積后期(60 ～75 d)顯著上升(P<0.05)，此階段種子發芽率也顯著上升(P<0.05)，說明桃兒七種子在休眠解除的過程中，種子內主要呼吸途徑由EMP—TCA途徑逐漸轉向PPP途徑，PPP途徑的活化是種子休眠解除的關鍵因素。

3.3 桃兒七種子休眠解除與內源激素的關系

植物激素在種子休眠與萌發的過程中起著重要作用，種子內源激素的消長平衡調控著種子的休眠水平。GA被認為是萌發促進類物質，而ABA被認為是萌發抑制類物質[33]。有關IAA對種子萌發和休眠的影響存在一定的爭議，有研究表明IAA具有釋放種子休眠、促進種子萌發的作用[34]，但也有學者認為IAA與ABA存在協同作用從而作用于種子休眠的正向調節[35]。何超等[36]研究發現納羅克非洲狗尾草種子在層積過程中ABA含量隨休眠的解除而下降。三七種子中ABA含量隨種子后熟過程而呈下降趨勢，從而導致其休眠解除[37]。有學者認為破除種子休眠、促進萌發因素的不僅僅是內源激素絕對含量，而且還和萌發促進物和抑制物的比例有關[38]。研究表明在低溫層積過程中徠木種子GA含量隨層積時間的延長而逐漸增大，種子內GA/ABA增大有利于種子休眠解除和萌發[39]。趙迪等對露蕊烏頭的研究也得出類似結果[34]。本研究結果表明，桃兒七種子ABA含量在整個層積過程中變化平緩且其含量在層積前后無顯著差異(P<0.05)，而GA含量及IAA含量在層積后期顯著升高，GA/ABA、IAA/ABA、(GA+IAA)/ABA的比值均在層積后期呈上升趨勢，且IAA/ABA、(GA+IAA)/ABA的比值在層積前后出現顯著上升(P<0.05)。說明IAA對解除桃兒七種子休眠具有正向調控作用，萌發促進物和抑制物比例(GA/ABA、IAA/ABA、GA+IAA/ABA)的升高及IAA含量的顯著上升是桃兒七種子休眠解除的關鍵因素。