8 個雜交水稻新組合種子純度的分子標記鑒定

蔣鈺東 何茹薇 羅俊濤 楊 揚 鄭 軍 付 均 曾正明

（1 四川省農業科學院水稻高粱研究所/農業部西南水稻生物學與遺傳育種重點實驗室，德陽 618000；2 國家水稻改良中心四川瀘州分中心，瀘州 646100）

水稻是我國最重要的糧食作物之一，我國約有65%的人口以稻米為主食，因此保障水稻的正常生產對我國糧食安全有著重要作用。目前我國水稻常年種植面積維持在3000 萬hm2，雜交水稻占我國水稻種植面積的55%左右，雜交水稻比常規水稻品種產量優勢明顯，一般可增產20%左右，優勢品種增產幅度更大，雜交水稻的應用和推廣使得我國水稻單產大幅度提高，對保障我國水稻生產具有重要貢獻[1]。雜交種純度的高低直接影響雜交水稻的種子質量，種子質量是決定水稻大田生產中產量表現的關鍵，也是決定種子公司生產的產品在市場上具備強大競爭力的重要因素，是種子公司安身立命之本。檢驗雜交種子的純度是每個種子公司將雜交種子推向市場前的必要環節[2]。目前田間種植鑒定種子純度是最為普遍的檢驗方法，主要通過在海南加代種植或正季種植期間，對水稻進行全生育進程的農藝性狀觀察，比對各單株間的典型性狀，通過品種的農藝特征特性鑒別真實雜交種及雜株[3]。海南種植鑒定有時間相對提前的優勢，在當年冬季就能鑒定出純度結果，但在海南冬季短日照低溫的條件下，對感光類型的雜交水稻品種的鑒定結果往往不太準確。正季種植鑒定結果準確度高，但時間明顯滯后，從生產上重大種子純度事故來看，當得知種子純度不合格時，種子已流入市場，損失也已無法挽回。隨著分子標記技術的發展，SSR分子標記檢測技術被廣泛應用于雜交種子的純度鑒定中，SSR 標記是在水稻分子層面上鑒定，主要是利用不同水稻品種遺傳組成不同，基因組DNA 中簡單重復序列的重復次數有差異。通過PCR 擴增及電泳方法檢測出差異，從而能夠將不同品種精準區分。SSR 標記具有數量豐富、多態性高、遺傳上呈共顯性、實驗操作簡單、結果穩定可靠等特點[4]。

本研究利用SSR 標記技術對新配制雜交組合的雙親進行多態性篩選，分別篩選出在雙親之間顯示出良好多態性的引物，然后對雜交種子進行純度鑒定，同時進行田間種植鑒定，兩種方法的結果進行比較來驗證SSR 標記檢測8 個雜交組合種子純度的準確性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料親本不育系為新育三系不育系6026A。親本恢復系共計8 份：德恢6099、旌香占、粵禾絲苗、德恢5292、瀘恢1611、R2195、R5004和R4149。

8 個雜交水稻新組合：6026A/德恢6099、6026A/旌香占、6026A/粵禾絲苗、6026A/德恢5292、6026A/瀘恢1611、6026A/R2195、6026A/R5004、6026A/R4149。試驗所用種子均是2020 年夏季新生產的雜交水稻種子。

1.2 基因組DNA 提取和檢測采用簡易CTAB法[5]提取水稻嫩葉片總DNA，并利用核酸檢測儀檢測提取DNA 樣品濃度和質量。利用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物。

1.3 篩選引物利用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規程SSR 標記法》中的48 對引物進行雙親多態性檢測，引物由擎科生物科技有限公司合成。選用各組合多態性標記用于后續雜交稻種子純度檢測。

1.4 SSR 標記鑒別種子純度利用雙親間具有多態性的SSR 引物，對200 株雜交種幼苗進行純度鑒定，盡量選擇2 對SSR 引物進行檢測，擴增帶型與標準帶型不一致時，判定其為雜株。統計父本、母本和雜種種子數占被測種子數的比例。

1.5 田間種植鑒定種子純度每個組合在海南田間分別種植200 株，單本栽插，栽插規格16.5cm×26.4cm。在整個生長階段觀察品種的特征特性，控制化肥和除草劑的使用劑量，以免影響植株本身的特征特性。在抽穗前及齊穗后依據GB/T 3543.5—1995《農作物種子檢驗規程真實性和品種純度鑒定》進行田間純度鑒定，根據品種特征特性對明顯雜株及可疑植株用掐葉的方法進行標記，并詳細記錄下雜株類型和數量[6]。

2 結果與分析

2.1 雜交組合引物篩選由表1 可知，經過對雙親間引物多態性篩選，在6026A/德恢6099 親本間表現多態性的引物有RM208、RM232、RM17、RM493、RM2877、RM21 和RM3331；在6026A/德恢5292 親本間表現多態性的引物有RM19、RM274；在6026A/R2195 親本間表現多態性的引物有RM219、RM19；在6026A/R5004 親本間表現多態性的引物有RM311、RM19；在6026A/瀘恢1611親本間表現多態性的引物有RM71、RM19；在6026A/旌香占親本間表現多態性的引物有RM17、RM432；在6026A/R4149 親本間表現多態性的引物僅有RM17；在6026A/粵禾絲苗親本間表現多態性的引物有RM274、RM201、RM232。

表1 雜交稻組合及可用于純度鑒定的SSR 標記

2.2 利用SSR 標記的雜交種純度檢測分別選取8 個雜交組合F1中的200 個單株，利用在6026A/德恢6099 雙親表現為多態性的2 個SSR 標記（RM208 和RM17）檢測發現，有195 個單株在2 個標記座位上均呈現為雙親的互補帶型，可判斷為真實的6026A/德恢6099 F1種子，余下5 個單株在其中1 個標記座位上（RM17）呈現為雙親的互補帶型，但在另外1 個座位上（RM208）表現為德恢6099 純合型，說明該單株為混雜的其他雜合型材料（圖1，表2）。利用6026A/德恢5292 雙親表現為多態性的2 個SSR 標記進行檢測發現，有6個單株在2 個座位上（RM19 和RM274）表現為其他類型，其余194 個單株在此2 個座位上均呈現雙親的互補帶型；利用6026A/R2195 雙親表現為多態性的2 個位點（RM219 和RM19）進行檢測發現，有12 個單株在2 個座位上表現為其他型，其余188 個單株在此2 個座位上均呈現雙親互補帶型；利用6026A/R5004 雙親表現為多態性的2 個位點（RM311 和RM19）進行檢測發現，27 個單株在2 個座位上表現為其他型，其余173 個單株均呈現雙親互補帶型；利用6026A/瀘恢1611 雙親表現為多態性的2 個位點（RM71 和RM19）進行檢測發現，有8 個單株在2 個座位上表現為其他型；利用6026A/旌香占在RM17 和RM432 位點上表現為多態性，檢測發現5 個單株在2 個座位上表現為其他型；利用6026A/R4149 僅在RM17 位點上表現為多態性，檢測發現僅有3 個單株表現為其他型，其他單株表現為雙親互補帶型；利用6026A/粵禾絲苗在RM274 和RM201 位點上表現為多態性，檢測發現7 個單株表現為其他型，193 個單株呈現雙親互補帶型。

表2 雜交水稻種子SSR 純度鑒定結果

圖1 標記RM17 對6026A 和德恢6099及其雜交種純度檢測

2.3 田間種植鑒定結果同年冬季在海南基地種植各雜交組合200 個單株進行田間觀察，從表3 結果發現，雜交組合6026A/R5004 發現3 株相近異形株，其生育期、植株形態與鑒定組合相似，只是葉邊緣、葉鞘顏色和粒寬上有明顯不同。其次，發現每個組合都有不同程度雜株，6026A/德恢6099與6026A/旌香占雜株類型主要表現為植株矮、生育期早以及完全不同形態的植株（疑是制種田飛花所致）；6026A/瀘恢1611 和6026A/粵禾絲苗雜株類型主要表現為抽穗期遲、高株、株型差異大等；6026A/R2195、6026A/德恢5292 和6026A/R4149的雜株類型主要表現為株葉形態和籽粒性狀上的差異。8 個組合中，田間純度最好的是6026A/德恢6099，為95.5%；最差的為6026A/R5004，僅為81.5%，但所有組合的純度整體還是較差，均達不到雜交稻96%的純度標準。

表3 試驗組合抽穗期及田間純度結果

2.4 SSR 鑒定與田間種植鑒定結果對比比較表2 和表3 可以看出，SSR 鑒定與田間鑒定結果比較接近，差值范圍2%～7%，各雜交組合田間種植純度鑒定與SSR 鑒定純度的趨勢是一致的，而SSR 鑒定純度結果比田間鑒定結果數值高（圖2）。

圖2 SSR 鑒定與田間鑒定的種子純度對比

3 討論

傳統的種子純度鑒定方法主要是田間種植觀察鑒定，而田間種植鑒定的結果準確性受到鑒定者的技術經驗、田間栽培管理水平、天氣環境等因素影響[7]。隨著DNA 分子標記技術不斷發展，SSR 標記檢測快速高效的優勢使其在雜交水稻種子純度鑒定中越來越廣泛使用[8]。眾多研究結果表明，SSR 標記檢測與田間鑒定種子純度均有一定差異，這種差異變化呈無規律性，主要因為SSR 鑒定針對單一的不育系、恢復系和混入的常規品種可以準確區分，但對于部分串粉混雜和變異株不容易區分，主要因為田間串粉混雜造成的雜株類型很復雜，部分雜株類型在單個SSR 標記可能沒有表現出多態性，此外SSR 鑒定的準確性還受到DNA 提取質量、電泳操作和引物的影響；另一方面是因為田間種植鑒定的結果準確性受到鑒定者的經驗、栽培管理、環境條件等因素干擾[9]。總體結果比較，SSR 標記檢測和田間鑒定結果趨勢相同，差異幅度較小[10]。對于現代種企而言，可以利用室內和田間鑒定相結合的方式，快速、精準、高效地鑒定雜交種子純度，以保證推向市場種子的質量[11]。

本研究利用SSR 標記技術檢測新配制的8 個雜交組合的種子純度，并同田間鑒定結果相比較。研究結果表明，利用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規程SSR 標記法》中48 對標記，篩選出8 個雜交組合的共顯性標記鑒定各雜交組合種子純度，SSR 標記檢測結果顯示各組合的種子純度在86.5%～98.5%之間，種子純度比海南田間鑒定結果稍高，這種情況有可能是樣本數或SSR 標記數較少的原因。整體而言，2 種方法鑒定結果較為相近，說明利用SSR 標記檢測雜交組合種子純度是可行的。因此，為保證雜交稻種子純度，一是擴大樣本量，二是選擇多個共顯性標記進行檢測，但考慮成本及檢測時間，應至少選取2 對及以上共顯性標記進行檢測，當2 個標記檢測純度一致時，檢測結果更加準確。

本研究通過利用SSR 分子標記技術，篩選出可利用的共顯性標記，形成了一套準確、快速、簡單的鑒定雜交種純度的技術體系，對新配制的8 個雜交組合種子純度進行了快速鑒定，加快了育種工作進程。