miR-522促進食管癌增殖和轉移的作用機制研究

許明召，景凱，崔貴，李易桐，邢涪涵

食管癌是全球與癌癥相關死亡的第六大原因，全世界每年報告近33萬新發病例，每年死于食管癌的人數超過27萬例[1]。盡管食管癌診斷技術和治療手段在不斷的進步，但是由于食管癌患者早期無明顯癥狀，通常在晚期時被確診，其預后仍然較差[2]。由于致癌物暴露和營養缺乏，中國是食管癌的高危地區，情況更為嚴重，因此迫切需要探索食管癌新的治療手段以改善患者的預后[3]。微小RNA(microRNA, miRNA)是小的內源性非編碼RNA，在腫瘤的發生發展過程中起著至關重要的作用[4]。miR-522是與腫瘤惡性進展密切相關的miRNA之一，研究報道其在不同的腫瘤中發揮不同的生物學功能。研究顯示，miR-522在卵巢癌和子宮內膜癌等腫瘤中發揮抑癌作用[5-6]；而在骨肉瘤、肝細胞肝癌和胃癌等腫瘤中發揮促癌作用，密切調控腫瘤細胞的增殖、轉移和耐藥等惡性生物學行為[7-9]，可作為抗腫瘤治療的潛在靶點。但miR-522在食管癌中尚未有研究報道，因此，現觀察miR-522在食管癌中的表達水平及作用，旨在獲得miR-522作為抗食管癌潛在分子靶點的實驗室依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月—2015年6月遼寧省健康產業集團阜新礦總醫院心胸外科行食管癌根治性手術60例，患者術前未接受過任何形式的治療，病理證實為食管癌組織。其中男33例，女27例；年齡：≤60歲26例，>60歲34例；腫瘤大小：<3 cm 40例，≥3 cm 20例；淋巴結轉移：無 21例，有 39例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期14例，Ⅲ期15例，Ⅳ期13例。本研究經醫院倫理委員會審核，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀測指標與方法

1.2.1 不同組織miR-522表達檢測：將手術中留取的食管癌和癌旁組織(距離腫瘤5 cm的非癌食管組織) 加入Trizol裂解液(北京百奧萊博科技有限公司)，移至EP管中加入氯仿，低溫高速離心20 min，吸取上層液體加入異丙醇試劑混勻，低溫高速離心20 min，加入無水乙醇洗滌2次后加入DEPC液，獲得組織總RNA。采用OneStep RT-PCR試劑盒(德國Qiagen公司)進行RNA逆轉錄和qRT-PCR擴增反應，其體系為QIAGEN One Step RT-PCR Buffer 4 μl、dNTP Mix 1 μl 、QIAGEN One Step RT-PCR Enzyme Mix 0.8 μl、上下游引物各0.4 μl、RNA 1 μg和DEPC液補足20 μl。反應條件為逆轉錄50℃ 30 min、95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環，72℃終延伸10 min。miR-522上游引物：5’-TTTGGATCCAGCTAACCTGCTGATTCTTTG-3’，下游引物：5’-TAAGAATTCAGGTCGCAGTGAGCAGAGT-3’；GAPDH上游引物：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，下游引物：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。按照2-ΔΔCt公式以GAPDH為內參計算miR-522的相對表達量。miR-522和內參GAPDH引物由上海生工試劑公司合成。

1.2.2 食管癌細胞系培養和轉染：食管癌細胞系GES-1、MKN1和Eca109及人正常食管黏膜上皮細胞系HEEC(中國科學院細胞庫)均采用含有10%胎牛血清的細胞培養基(美國Gibco公司)培養，放置在5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養。細胞長滿時采用胰酶(美國Gibco公司)消化進行細胞傳代。收集細胞斑塊，加入Trizol裂解液提取細胞總RNA。采用qRT-PCR檢測各個細胞系中miR-522的表達水平。miR-522表達最高的Eca109細胞以每孔2×105個接種至6孔板中，隨機分為NC組和miR-522抑制劑組，細胞貼壁后采用脂質體2000進行細胞轉染。NC組轉染10 pmol/L NC 抑制劑，miR-522 抑制劑組轉染10 pmol/L miR-522 抑制劑(廣州瑞博生物試劑有限公司)，培養48 h后采用qRT-PCR檢測NC組和miR-522 抑制劑組Eca109細胞中miR-522的表達。

1.2.3 食管癌細胞增殖檢測:NC組和miR-522 抑制劑組分別以每孔1 500個Eca109細胞重懸至150 μl培養基中，每組設置6個重復孔接種至96孔板中。分別在貼壁后的0 h、24 h、48 h和72 h時，更換新鮮培養基并加入 MTS試劑20 μl(美國Sigma公司)，放置培養箱中繼續培養2 h，采用酶標儀檢測NC組和miR-522 抑制劑組Eca109細胞在490 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.4 食管癌細胞周期檢測：胰酶消化收集NC組和miR-522 抑制劑組食管癌Eca109細胞，PBS緩沖液洗滌3次后按照細胞周期檢測試劑盒(上海碧云天生物試劑有限公司)說明書進行染色，以每管6×105個Eca109細胞中加入500 μl染色緩沖液、 PI染色試劑25 μl和RNA酶10 μl混勻，37℃避光孵育30 min，于流式細胞儀上機檢測，Flow Jo軟件進行數據分析。

1.2.5 食管癌細胞轉移檢測：NC組和miR-522 抑制劑組食管癌Eca109細胞胰酶消化后，無血清培養基洗滌3次，以每孔1×105個Eca109細胞重懸至無血清培養基100 μl中，接種至Transwell小室(美國Coring公司)上室膜上，下室加入含有10%胎牛血清的培養基500 μl作為趨化因子，每組設置3個重復孔。放置培養箱中培養10 h后終止細胞培養。將Transwell小室膜上室面未穿過的細胞擦去后，PBS緩沖液洗滌3次后甲醇固定10 min，吉姆薩染色10 min后在顯微鏡下計數細胞穿膜數目。

1.2.6 食管癌細胞蛋白檢測：胰酶消化收集NC組和miR-522 抑制劑組食管癌Eca109細胞，加入蛋白裂解液(上海貝博生物科技公司)，超聲裂解細胞30 min，離心后將上清移至新EP管中，獲得細胞總蛋白。并采用BCA試劑盒(美國Thermo公司)檢測蛋白濃度，加熱煮沸蛋白變性后上樣進行凝膠電泳，80 V電泳2 h，并350 mA將蛋白轉移至PVDF膜(美國Promega公司)上。5%封閉液室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后，與一抗稀釋液4℃孵育過夜(CyclinD1、CDK4、CDK6、E-cadherin、N-cadherin、Snail稀釋液均為1∶500，抗體均購自美國cell signaling公司)，與二抗稀釋液室溫孵育2 h，蛋白條帶采用ECL化學發光試劑盒(上海慧穎生物科技有限公司)進行曝光。

2 結 果

2.1 不同組織miR-522表達 食管癌組織 miR-522相對表達量為(2.11±0.81)，高于癌旁組織的表達(1.44±0.75)，差異有統計學意義(t=4.912，P=0.000)。

2.2 食管癌細胞系及HEEC細胞中miR-522表達比較 miR-522在食管癌細胞系TE-1、TE-8、Eca109和人正常食管上皮細胞系HEEC中的表達水平分別(3.39±0.60)、(4.78±0.89)、(6.66±0.67)和(1.14±0.06)， miR-522在食管癌細胞中的表達顯著高于人正常食管上皮細胞HEEC，其中在Eca109細胞中的表達最高(F=40.427，P=0.000)，因此選擇Eca109細胞進行后續miR-522的功能研究。

2.3 miR-522 抑制劑轉染效果 NC組miR-522的表達量為(1.00±0.04)，高于miR-522抑制劑組的 (0.32±0.06)，差異有統計學意義 (t=16.334,P=0.000)。

2.4 miR-522抑制劑對Eca109細胞增殖能力的影響 MTS實驗結果顯示，NC組0 h、24 h、48 h、72 h OD值分別為0.29±0.01、0.62±0.10、1.01±0.13、1.35±0.07，miR-522抑制劑組分別為0.29±0.01、0.40±0.05、0.55±0.12、0.75±0.15。2組24 h、48 h、72 h比較差異有統計學意義(t=3.557、4.623、6.412,P=0.024、0.010、0.003)。

2.5 miR-522 抑制劑對Eca109細胞轉移能力的影響 Transwell實驗結果顯示，NC組細胞的穿膜細胞數為(68.67±8.23)個，高于miR-522 抑制劑組的(24.33±6.27)個，差異有統計學意義 (t=7.421,P=0.001)，見圖1。

圖1 Transwell實驗檢測miR-522對Eca109細胞轉移能力的影響

2.6 miR-522抑制劑對Eca109細胞周期的影響 流式細胞儀實驗結果顯示,NC組Eca109細胞G1、S、G2期分別為(58.80±3.94)%、(23.37±2.98)%、(16.50±4.75)%，miR-522抑制劑組分別為(69.10±4.75)%、(18.00±0.01)%、(12.91±3.73)%。與NC組比較，miR-522抑制劑組Eca109細胞僅G1期細胞顯著增加(t=2.885、2.598、1.281，P=0.045、0.060、0.269)。

2.7 miR-522抑制劑對Eca109細胞周期和EMT相關蛋白表達的影響 Western-blot結果顯示,與NC組比較，miR-522抑制劑組細胞中細胞周期相關蛋白CyclinD1、CDK4、CDK6表達降低(t/P=8.521/0.000,5.792/0.002,7.746/0.001)，EMT相關蛋白N-cadherin、Snail表達降低(t/P=7.359/ 0.001,8.133/0.000)，E-cadherin蛋白表達增加(t/P=6.264/0.002),見圖2。

圖2 miR-522抑制劑對Eca109細胞周期和EMT相關蛋白的影響

2.8 食管癌組織miR-522表達與患者臨床病理參數的關系 miR-522的表達在食管癌患者性別、年齡和腫瘤大小間比較差異均無統計學意義(P>0.05)，有淋巴結轉移和TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期表達均升高(P<0.05)，見表1。

表1 miR-522表達在不同食管癌患者臨床/病理參數中比較Tab.1 Comparison of miR-522 expression in esophagealcancer patients with different clinical/pathological parameters

2.9 miR-522的表達水平對食管癌患者預后的影響 以miR-522表達水平2.11為界值，將60例食管癌患者分為miR-522高表達亞組(32例)和miR-522低表達亞組(28例)。隨訪5年，Kaplan-Meier繪制患者生存曲線，Log Rank結果顯示，miR-522高表達亞組患者預后較miR-522低表達亞組預后差(χ2=4.468，P=0.035)，見圖3。

圖3 miR-522不同表達水平食管癌患者預后比較

3 討 論

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，具有很高的致死率，其發病率和病死率在全球范圍內存在差異，在經濟欠發達的地區較為普遍[1]。食管癌的治療手段主要包括手術切除、化療、放療和分子靶向治療，現有的治療手段未能改善患者的預后，目前接受治療的食管癌患者5年生存率僅為25%～30%[2]。食管癌的主要危險因素是飲酒、吸煙和引起食管黏膜慢性刺激的疾病[3]，但是其發病機制尚未完全明確，因此研究食管癌發生發展中發揮關鍵作用的分子，是尋找用于治療食管癌分子靶標的重要途徑。

miRNA是一類長度為20～25個核苷酸的非編碼RNA，雖然不具備編碼蛋白質的功能，但可通過抑制其靶基因的翻譯或通過與3’非翻譯區結合而使其靶mRNA降解來調節基因表達。超過50% miRNA的靶基因位于與腫瘤相關的基因組區域，表明miRNA與腫瘤的發病機制密切相關[4]。在食管癌中異常表達并發揮重要作用的miRNA被越來越多報道。miR-522在多種人體組織中表達，并在子宮內膜癌、骨肉瘤、肝細胞肝癌等多種類型的腫瘤中表達失控，并與腫瘤的發生發展密切相關[6-8]。苗志龍等[8]報道miR-522在肝細胞肝癌組織中表達顯著升高，且與淋巴結轉移、腫瘤分級較差及患者預后較差顯著相關，miR-522過表達可作為肝細胞肝癌患者預后不良的生物標志物。miR-522在食管癌中的表達及意義未知，而本研究發現，食管癌組織中高表達的miR-522與患者的淋巴結轉移、TNM分期和不良預后相關，與miR-522在肝細胞肝癌中表達的臨床意義相似，同時也表明miR-522高表達促進食管癌的惡性進展，可能是食管癌患者預后不良的生物分子標志物。同時本研究檢測了miR-522在食管癌細胞系中的表達水平，結果顯示，miR-522在4株食管癌細胞系中的表達顯著高于人正常食管上皮細胞系HEEC中的表達，與在組織水平的表達相一致，可以進行miR-522在食管癌細胞中的功能研究。

在胃癌細胞中外泌體分泌來源的miR-522通過抑制鐵死亡促進胃癌細胞化療耐藥，在骨肉瘤和肝細胞肝癌中miR-522促進腫瘤細胞增殖和轉移[7,9-10]，提示miR-522與腫瘤的增殖和轉移等腫瘤惡性生物學行為相關。而本研究顯示，抑制miR-522的表達后，食管癌細胞的增殖和轉移能力降低，與miR-522在其他癌種的研究一致，均發揮促癌作用，但是作用機制需進一步探討。研究顯示，細胞周期與細胞增殖密切相關，其調控紊亂不受控制后是導致細胞惡性增殖的主要機制之一[11]。在肝細胞肝癌中miR-522過表達促進細胞增殖、集落形成和細胞周期G1期至S期的進程，并促進細胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表達[10]。本研究發現，抑制miR-522的表達后，食管癌細胞周期阻滯在G1期，表明miR-522在食管癌中同樣通過調控細胞周期促進腫瘤細胞的惡性增殖，與Zhang等[10]的報道一致。而細胞周期進程是機體通過細胞周期蛋白及細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)等一系列蛋白經過嚴格的調控機制完成的，CDKs是包括20個蛋白激酶的家族，其中CDK4和CDK6通過與CyclinD1特異性結合促進G1期至S期的進程[12]。本研究采用Western-blot檢測結果顯示，抑制miR-522的表達后食管癌細胞中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表達均減少，表明miR-522通過調控G1/S期的細胞周期蛋白加速細胞周期進程進而促進細胞增殖。EMT是促進惡性腫瘤轉移的重要機制，上皮標志物E-cadherin蛋白表達減少及間皮標志物N-cadherin蛋白表達增加促進EMT，Snail1通過抑制E-cadherin的轉錄而誘導EMT[13-15]。本研究發現，抑制miR-522表達后食管癌細胞中E-cadherin蛋白表達增加，N-cadherin和Snail1蛋白表達減少。表明miR-522通過調控EMT促進食管癌細胞轉移，與Xu等[7]在骨肉瘤中的報道一致。

綜上所述，miR-522在食管癌中表達上調，與食管癌惡性進展相關，干擾miR-522的表達后通過調控細胞周期抑制細胞增殖及通過抑制EMT降低細胞轉移能力。miR-522可能是食管癌預后不良的分子標志物和抗腫瘤治療的潛在分子靶標。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

許明召、崔貴：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；景凱：進行統計學分析;李易桐：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;邢涪涵：課題設計，論文撰寫