microRNA在心搏驟停后腦損傷中的研究進展

王靜綜述 謝吐秀，呂菁君審校

microRNA(miRNA)作為一種小的非編碼RNA分子，含18～22個核苷酸，在轉錄后水平通過抑制翻譯和/或降解編碼目標蛋白的mRNA來調控基因表達[1]。在大腦中，miRNA在神經細胞的分化、胚胎的神經系統發育、樹突和突觸可塑性中發揮重要作用[2]。有研究表明，心搏驟停(cardiac arrest，CA)期間，大腦缺血缺氧會導致缺血性腦損傷，其外周循環中存在的腦源性miRNA水平反映了血腦屏障受損和神經細胞死亡的程度[3]。近年來的研究發現，miRNA在CA后腦損傷的發生、發展中起著至關重要的作用，可能成為預測和治療CA后腦損傷的潛在靶點。因此，亟需進一步探索miRNA在CA后腦損傷中的病理生理特點及分子機制。本文擬從miRNA概述、CA后腦損傷概述和miRNA在CA后腦損傷中的作用及機制三方面進行綜述，旨在為CA后腦損傷的預測和治療提供理論基礎。

1 microRNA概述

生物體內RNA種類繁多，功能復雜。一般根據其能否編碼蛋白質分為編碼RNA和非編碼RNA，前者主要是指mRNA,后者則包括rRNA、tRNA、miRNA等。在miRNA家族中，其生物發生存在差異，但均會經歷從細胞核進入細胞質，最終都會形成功能性核糖核蛋白復合物，又稱為RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。在細胞核中，初級miRNA (pri-miRNA)以染色體DNA為轉錄模板，由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ催化轉錄，然后被RNase Ⅲ Drosha和DGCR8切割成雙鏈發夾狀前體miRNA (pre-miRNA)。隨后，pre-miRNA經 Exportin5/RanGTP復合物穿梭到細胞質中，由RNase Ⅲ Dicer進一步加工形成成熟的 miRNA雙鏈體[5]。成熟的miRNA與Argonaute家族蛋白結合，形成RISC，并與靶標 mRNA 的 5' UTR 相互作用，在轉錄后水平通過抑制翻譯或切割mRNA來調控基因表達[5]。成熟的細胞外miRNA可被包裝到外泌體、微粒、脂囊泡中，并與Argonaute-2、nucleophosmin-1蛋白、高密度或低密度脂蛋白結合，分泌到血液循環中以保護其不被核糖核酸酶降解[6]。近年來的研究發現，一種miRNA可同時與多個靶基因的mRNA結合發生聯合作用,參與各種病理生理過程，如胚胎發育、細胞增殖、細胞凋亡、脂肪代謝、細胞分化等[3]。 目前常采用高通量miRNA芯片技術來研究miRNA和疾病的關系、診斷疾病，甚至將miRNA作為疾病治療靶點以研發新藥物或材料。

2 CA后腦損傷概述

CA作為全球的一種臨床急癥，具有極高的致死率和致殘率，可導致廣泛的腦損傷和認知障礙。由于神經元主要依賴于有氧呼吸，因此，在CA自主循環停止期間大腦更易出現不可逆性損害，從而導致死亡、昏迷、持續植物人狀態，以及許多其他神經功能障礙。有研究表明，CA后腦血流立即停止可引起大腦原發性損傷，在再灌注后的數小時和數天可出現更為嚴重的繼發性腦損傷和神經細胞死亡[7]。雖然CA后腦損傷的機制尚不完全清楚，但神經炎性反應已被廣泛認為起著重要作用，表現為神經膠質細胞的激活、外周免疫和炎性細胞的涌入及促炎介質的釋放，包括細胞因子和黏附分子[8]。小膠質細胞作為大腦中的先天免疫細胞，可能會被過度激活，并在這些炎性級聯反應中發揮主動作用。除此之外，細胞焦亡(pyroptosis)、細胞凋亡、自噬、壞死性凋亡、氧化應激和內質網應激等亦被認為與CA后腦損傷的發生發展密切相關[9-14]。可見，CA后腦損傷的病理機制是錯綜復雜的。近年來的研究發現，盡管心肺腦復蘇指南一直處于不斷更新和完善中，但CA后腦損傷患者的預后仍然不容樂觀。尋找新的CA后腦損傷預測指標和進一步探明其相關的分子機制，以更好地治療CA后腦損傷患者迫在眉睫。

3 miRNA在CA后腦損傷中的作用及機制

3.1 miRNA可作為CA后腦損傷的生物標志物 目前CA后的神經功能評估一般是在成功復蘇后至少72 h，但仍有許多因素會混淆CA后的神經預后評估，包括治療性低溫、使用鎮靜劑、神經肌肉阻滯劑及全身缺血引起的代謝紊亂[3]。NSE作為腦損傷后釋放到血液中的一種蛋白質，一直以來被當作CA后的預后標志物，但其本身具有一定的局限性，如敏感度低、容易增加假陽性結果[15]。近年來的研究發現，在病理情況下，miRNA可較蛋白質更早地釋放，且其表達水平可使用定量PCR、微陣列和高通量測序等輕松檢測，在預測神經功能方面具有高特異度和敏感度等優點[16]。神經功能預后差的院外CA患者血清miR-122和miR-2顯著上調，而miR-191-5p呈顯著下調，可作為CA后腦損傷的預測因子[17-18]。Stefanizzi等[19]的研究結果亦證實，CA后患者循環中的腦源性miR-9-3p、miR-124-3p、miR-129-5p的水平與NSE水平、6個月時的神經功能和存活率顯著相關。此外，循環中的miR-574-5p水平與女性CA后的神經功能結果顯著相關[20]。最近的一項研究發現，前腦缺血后3 h時，miR-100-5p和miR-125b-5p的表達在海馬CA1區呈顯著上調；在再灌注24 h后，miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-181a-5p、miR-219a-2-3p、miR-23b-3p和miR-338-3p在齒狀回(dentate gyrus，DG)中顯著上調；在再灌注72 h時，miR-219a-2-3p在DG中顯著上調，而miR-329-3p在CA1區顯著上調[21]?？梢?，miRNA有望成為預測和治療CA后腦損傷的生物標志物。然而，目前尚不清楚CA后釋放到循環中的大腦特異性miRNA的動力學，以及何時測定miRNA可準確預測神經功能預后。此外，不同樣本來源的miRNA水平與神經功能預后及病死率的關系需待進一步探討。

3.2 miRNA在CA后腦損傷中的調控機制 miRNA在調控CA后腦損傷過程中起著十分重要的作用，尤其是在CA后的神經炎性反應和神經元死亡方面。近年來研究發現，miRNA參與調控CA后腦損傷的具體機制錯綜復雜，目前主要涉及的是神經炎性反應、氧化應激和細胞凋亡，且其相互之間存在串擾。

3.2.1 miRNA在CA后腦損傷中調控炎性反應：越來越多的研究表明，炎性反應是CA誘導的短暫性全身缺血后神經功能缺陷的主要致病因素[22]。并且，CA后腦損傷的各個階段均與炎性反應有關，通?？赏ㄟ^增加炎性因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，啟動下游的中樞促炎細胞因子信號通路來加重神經損傷[23]。近年來的研究表明，miRNA在CA后腦損傷所致的炎性反應中發揮著重要的作用[22, 24]。Sun等[24]研究表明，CA后大鼠海馬回的miR-155顯著上調，可顯著增強IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，而抑制海馬回miR-155的表達，可顯著降低上述炎性因子的水平。其可能機制為miR-155-5p是通過靶向DUSP14，激活NF-κB和MAPKs信號通路來引發神經元炎性反應，繼而加重腦I/R損傷的[25]。此外，在腦I/R損傷過程中，miR-124-5p可直接與CYBB 3'-UTR結合并負性調節CYBB和NOX2的表達，且miR-124的過表達可通過負性調控NOX2顯著抑制NF-κB信號激活和TNF-α、IL-6的產生[26]。

小膠質細胞作為中樞神經系統先天免疫反應的第一線，在CA后幾分鐘即被激活[27]。有研究表明，CA后腦損傷的初始炎性反應是小膠質細胞的激活，并且腦損傷的早期，小膠質細胞具有抗炎作用(M2表型)，而在腦損傷晚期，具有促炎作用的小膠質細胞(M1表型)會分泌炎性因子，如TNF-α、Toll樣受體4、基質金屬蛋白酶9等，來增加血腦屏障的通透性[9]。目前，小膠質細胞活化相關機制已成為腦I/R損傷的研究熱點。有研究發現，在大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)誘導的腦缺血小鼠模型中，皮質、海馬和基底節區的miR-424在缺血后8 h時呈顯著低表達，且小膠質細胞被激活；而過表達miR-424可通過將小膠質細胞周期阻滯在G1期來抑制小膠質細胞的活化，繼而減輕神經炎性反應[28]。Ni等[29]的研究發現，缺血性卒中的患者和動物血漿中miR-7c-5p呈顯著低表達，而miR-7c-5p的過表達除了可以抑制炎性因子的釋放外，還可通過靶向Caspase3 mRNA的3'-UTR抑制Caspase3的表達來調控小膠質細胞M1和M2型轉變，繼而抑制神經炎性反應。NF-κB作為產生神經炎性反應的重要因素之一，在腦I/R損傷過程中受到miRNA的調控，繼而可加重或減輕腦損傷[30]。此外，miR-210可部分通過靶向SIRT1來誘導小膠質細胞M1型激活，繼而阻斷NF-κB亞基p65去乙?；?，并激活NF-κB信號通路，而抑制miR-210的表達則可有效抑制小膠質細胞介導的神經炎性反應，顯著減輕腦損傷[31]。除此之外，miR-210還可與TET2結合，通過促進NF-κB亞基p65發生乙酰化，增強其與小膠質細胞中IL-1β啟動子的DNA結合能力，繼而加重神經炎性反應[32]。盡管目前miRNA調控小膠質細胞活化的相關研究主要聚焦于缺血性腦卒中，但可以推測miRNA亦可調控CA后小膠質細胞介導的神經炎性反應[24]。并且，抑制小膠質細胞的過度反應和小膠質細胞介導的神經炎性反應可能是未來用于治療CA后腦損傷的重要策略之一。

3.2.2 miRNA在CA后腦損傷中調控氧化應激：以活性氧(reactive oxygen species，ROS)過量產生為特征的氧化應激是CA后I/R損傷的主要根源之一[13]。氧化應激在整個CA、心肺復蘇(CPR)期間都會出現，尤其是在CA后自主循環恢復(return of spontaneous circulation，ROSC)之后。既往的研究表明，適度的氧化應激可保護機體，而嚴重且持續的氧化應激會破壞機體的抗氧化防御機制，極易對細胞造成不可逆的損傷，尤其是神經元。核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應元件作為機體重要的內源性抗氧化信號通路，參與調控內源性抗氧化基因的表達[33]。有研究表明， ROSC后24 h海馬回的丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性升高，伴有GSK-3β的磷酸化被抑制，Nrf2易位到細胞核，HO-1的表達下調[10]。在許多I/R損傷過程中，miRNA被證明可通過microRNAs靶向Nrf2的3'-UTR或其上游的調節因子來調節Nrf2的表達和激活[34]，但其在CA后腦損傷中的作用及機制尚不清楚。最近的研究發現，CA后大鼠海馬回的miR-155上調可顯著增強氧化應激產物8-iso PGF2α和蛋白質氧化標志物8-OHdG的表達，而給予miR-155抑制劑后可通過抑制海馬回氧化應激產物和NADPH氧化酶的表達來改善神經嚴重程度評分和腦水腫[24]。Wang等[35]的長時間(60 min)體外循環大鼠模型研究發現，miR-29c的上調可抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α)的表達，增加丙二醛的表達，且術后14 d前庭功能和認知功能顯著降低；而給予深低溫(18℃)處理可通過抑制miR-29c的表達，啟動PGC-1α依賴性途徑來減輕長時間循環停止所致的神經損傷[35]。可見，CA后腦損傷期間，miRNA表達失?？烧{控氧化應激介導的神經元死亡，而通過抑制或增強miRNA的表達可提供神經保護作用。

3.2.3 miRNA在CA后腦損傷中調控細胞凋亡：miRNA已經成為腦I/R損傷期間神經元存活的關鍵調節因子。越來越多的研究表明，細胞凋亡是CA后腦損傷過程中神經元死亡的主要機制之一[36]。有研究發現[12]，CA后ROSC 24 h時，miR-26a顯著表達；而miR-26a的過表達可直接靶向GSK-3β的3'-UTR，導致β-catenin信號通路的激活，通過抑制大腦皮質神經干細胞凋亡，增加神經干細胞存活率來改善CA大鼠的神經功能?？梢姡琺iR-26a可通過調控神經干細胞凋亡來減輕CA誘導的腦損傷。Gao等[37]通過體外循環60 min大鼠模型發現，miRNA-23a的下調可促進神經元發生細胞凋亡，而給予深低溫(18℃)處理可通過顯著抑制海馬回生長停滯特異性蛋白5的表達來增強miRNA-23a表達，繼而降低PTEN和Bcl-2相關X蛋白的表達，以及增加Bcl-2的表達和磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B的比率，神經元凋亡被抑制，神經功能得到了保護。因此，敲低生長停滯特異性蛋白5可通過增強miRNA-23a的表達來抑制神經元凋亡，繼而減輕組織學損傷，并增加海馬體中存活的神經元數量。此外，Pan等[38]的大鼠CA模型表明，miR-126過表達可顯著下調大鼠海馬回p38MAPK、JNK和Caspase-3的表達，并上調ERK1/2的表達，通過抑制海馬回神經元凋亡來提高大鼠心肺復蘇后神經功能評分和改善海馬回的病理形態?？梢姡ㄟ^抑制或過表達miRNA可調控CA后神經元凋亡，這為治療CA后腦損傷開辟了一條潛在的道路。

多數研究表明，炎性反應、氧化應激和細胞凋亡在CA后腦損傷的發生發展均起著舉足輕重的作用，它們在調控機制上并非單獨發揮作用，可能存在著相互串擾[22]。

4 小 結

綜上所述，miRNA種類繁多，在CA后腦損傷中既可發揮保護作用，亦可加重腦損傷，且其調控機制錯綜復雜。目前已有大量研究表明，miRNA可預測CA后腦損傷的預后，且通過靶向miRNA抑制神經炎性反應、減少神經細胞死亡、促進神經細胞增殖和再生來減輕腦損傷。未來的研究應進一步深入探討miRNA在CA后腦損傷中的調控作用及機制，得出更多優質的miRNA，與傳統生物標志物聯合作為CA后腦損傷風險分層，預測CA早期、中期或長期預后和治療效果的工具。此外，還可以進一步深入探討在CA后腦損傷過程中，miRNA調控細胞焦亡、鐵死亡、壞死性凋亡、內質網應激及鈣超載等的具體機制，為更好的精準預測和治療CA后腦損傷提供理論依據。