宮腔灌注粒細胞集落刺激因子在不明原因反復種植失敗患者中的應用評價

夏婷婷，邵小光，魏晗，劉艷，李丹，印向，王磊

(大連市婦女兒童醫療中心(集團)，大連市生殖生命與母子遺傳重點實驗室，大連 116000)

反復種植失敗(repeated/recurrent implantation failure，RIF)目前是輔助生殖診療中的一大棘手問題，其定義尚不統一，現臨床中常用的定義為：年齡<40歲，移植達3次及以上或移植4～6個高評分卵裂期胚胎或3個及以上高評分囊胚均失敗[1]。在輔助生殖技術助孕的案例中，RIF的發生率約為5%～10%[2]。當排除子宮因素、配子及胚胎異常、以及免疫、內分泌功能、移植技術及心理因素等原因之外的反復種植失敗，定義為不明原因反復種植失敗(unexplained recurrent implantation failure，URIF)[3-4]。對于該類患者，目前尚無確切治療或者改善策略，臨床醫生僅能進行經驗性治療，比如提高胚胎質量或者改善子宮內膜容受性等，并無可靠證據顯示以上措施有效。URIF的治療是目前一大難題。

有研究表明，URIF可能與子宮內膜容受性異常相關[5]。子宮內膜容受性的評估方式主要包括形態學標志、分子生物學標志、基因及相關蛋白、類固醇激素及其受體及超聲下子宮內膜容受性的評估。腔內三維能量多普勒超聲成像(three dimensionalpower Dopple angiography，3D-PDA)是近幾年廣為應用發展的一項技術，其將多普勒和血流能量顯相技術相結合，對較低速血流靈敏度極高，對子宮內膜終末血流信號監測較為敏感，并可以對內膜的血管新生和血流灌注情況進行量化，對于子宮內膜容受性的評估具有方便、無創、可重復及依從性好等優點[6]。

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)近年來開始用于輔助生殖領域，因為子宮內膜存在G-CSF受體，故應用G-CSF宮腔灌注后可能改善子宮內膜容受性，目前主要用于薄性子宮內膜患者，也有用于RIF的研究[7-8]。對于URIF患者，G-CSF能否改善妊娠結局結論并不一致，有Meta分析支持G-CSF對URIF患者的著床率和臨床妊娠率有積極作用，而對流產率的影響尚無確鑿證據[9]，尚需更多的隨機對照實驗來證明G-CSF的有效性。本研究選擇G-CSF用于URIF患者人群，在目前尚無有效治療手段的情況下評估其臨床應用效果。對于子宮內膜容受性的判斷，采用能更客觀、更準確反應子宮內膜局部微循環狀況的三維彩超方式進行評估。通過三維彩超評估子宮內膜血流參數能更好的評估子宮內膜容受性，并有利于探索G-CSF宮腔灌注治療的作用機制。

資料與方法

一、研究對象

本研究采用了前瞻性雙盲隨機對照(包括自身對照)的研究方法，隨機選取2019年1月至2020年9月期間就診于大連市婦女兒童醫療中心(集團)的擬行人工周期-凍融胚胎移植(HRT-FET)的URIF患者120 例。

納入標準：符合RIF診斷標準(年齡<40歲，移植3次及以上或移植4～6個高評分卵裂期胚胎或3個及以上高評分囊胚均失敗)；已有卵裂期冷凍胚胎，計劃HRT-FET。

排除標準：RIF病因篩查后可能存在子宮因素、配子及胚胎異常、以及免疫、內分泌功能、移植技術及心理因素等原因；對G-CSF有過敏史患者；經充分知情同意后拒絕參與該項研究者。

共納入120例符合標準的患者，由研究者中指定人員進行隨機(數字表法)和雙盲處理，通過區組隨機法平均分為試驗組和對照組，每組60例。

本研究經過我院倫理委員會討論通過，所有患者充分知情同意簽署知情同意書。

二、研究方法

1.HRT周期準備內膜：月經第3天開始17β雌二醇(雌二醇2 mg/片；芬嗎通，雅培，荷蘭)4～6 mg/d，口服，根據內膜厚度調整雌激素用量；雌激素用藥第14天在原用藥基礎上加用孕激素轉化內膜，黃體酮注射液(20 mg/支；廣州白云山明興制藥)40 mg肌肉注射，地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)20 mg/d，口服。

2.G-CSF宮腔灌注：雌激素用藥第9天及第12天行宮腔灌注。試驗組灌注G-CSF(吉賽欣，華北制藥金坦生物技術)300 μg/1.2 ml，對照組灌注1.2 ml生理鹽水。患者取膀胱截石位，碘伏棉球常規消毒外陰，戴無菌手套，內診了解子宮位置及傾、曲角度，更換無菌手套，鋪無菌洞巾，置入窺器充分暴露宮頸，用鹽水紗球清洗陰道及宮頸3次，無菌棉簽清理宮頸外口粘液，輕柔將人工授精管放入至宮腔中上部(術前已超聲評估宮腔深度)，拔出管芯，連接裝有灌注液的2 ml注射器，緩慢將灌注液勻速推入宮腔，緩慢撤出人工授精管。囑患者平臥20～30 min后可下地自由活動。

為避免臨床操作中的技術誤差，所有患者的宮腔灌注均由同一有經驗醫師操作。

3.胚胎移植：內膜轉化第3日解凍1～2枚卵裂期優質胚胎(6～8細胞，碎片1～2級)，次日行腹式超聲引導下胚胎移植。所有患者的胚胎移植均由同一高年資醫生操作。

4.子宮內膜容積及子宮內膜血流參數測量：孕激素轉化日及孕激素用藥后第3天進行三維彩超內膜參數測定。患者排空膀胱后檢查，采用GE Voluson E8三維超聲系統(GE Healthcare，奧地利)及RIC5-9-D陰道探頭(GE Healthcare，奧地利)采集3D-PDA圖像。掃描參數預設：0.5～0.9 KHz，濾波檔low，能量多普勒增益5。利用此參數對子宮內膜進行120°慢掃，當顯示最完整的子宮內膜線時，按“FREEZE”鍵開始掃描，應用多平面成像模型描記感興趣區域中子宮內膜軌跡，軟件處理數據，選取虛擬器官計算機輔助分析(virtual organ computer-ai-ded analysis，VOCAL)功能，啟動手動描記模式畫出內膜界限，按照30°旋轉切面，由軟件自動生成內膜三維圖像，利用Histogram功能自動計算子宮內膜容積、內膜厚度、血流阻力指數(RI)、血管化指數(VI)、血流指數(FI)和血管化血流指數(VFI)等參數。每個研究對象連續取樣3次，以其平均值進行統計學分析。

參照Conen標準，將子宮內膜分為A型(內膜呈三線型)、B型(為過渡型)、C型(為均質強回聲型，超聲下未見明顯宮腔中線的回聲)。根據內膜及內膜下血流灌注情況分為I型(內膜區域可見血流信號，并接近宮腔中線)、Ⅱ型(內膜區域可見血流信號，但≤1/2單層內膜)、Ⅲ型(內膜下區域可見血流信號)[10]。

5.隨訪及數據收集：移植后12 d檢測血清β-HCG，如β-HCG>10 U/L，則判斷為HCG陽性，繼續用藥；移植后4～6周超聲觀察若可探及妊娠囊、卵黃囊及胎心搏動則診斷為臨床妊娠；早期流產定義為妊娠12周前發生胚胎停育或自然流產。

收集指標包括患者年齡、不孕年限、體質量指數(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)水平；孕激素轉化日及轉化后第3天內膜容積及血流指標；臨床結局指標包括胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產率等。

三、統計學分析

結 果

一、患者一般情況比較

本研究共納入擬行HRT-FET周期的URIF患者120例，其中試驗組60例、對照組60例。試驗組脫落5 例，完整隨訪55 例；對照組脫落4 例，完成隨訪56 例。共111例患者納入最終分析。

兩組患者間平均年齡、不孕年限、體質量指數(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)水平、移植胚胎數比較均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況的比較(-±s)

二、兩組患者內膜轉化前后子宮內膜比較

1.子宮內膜厚度、形態：試驗組內膜轉化日內膜厚度為(9.77±2.36)mm，對照組轉化日內膜厚度為(10.52±2.56)mm，兩組內膜厚度比較無統計學差異(P>0.05)；內膜轉化后第3天兩組內膜分別為(9.36±2.58)mm和(10.05±2.78)mm，組間無統計學差異(P>0.05)。內膜轉化日兩組內膜形態比較，試驗組A型內膜比例較對照組略高，但組間A、B、C形態的比例均無統計學差異(P>0.05)。內膜轉化后第3天A型內膜比例試驗組較對照組顯著增高(P<0.05)(表2)。

2.兩組患者內膜轉化日子宮內膜容積及血流參數的比較：轉化日兩組子宮內膜容積以及血流參數RI、VI、FI、VFI的比較均無統計學差異(P>0.05)，內膜下血流(Ⅰ、Ⅱ/Ⅲ型)比較亦無統計學差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者內膜轉化前后子宮內膜狀況比較[(-±s)，n(%)]

表3 兩組患者內膜轉化日子宮內膜容積、血流參數比較[(-±s)，n(%)]

3.兩組患者內膜轉化后第3天子宮內膜容積及血流參數的比較：轉化后第3日兩組子宮內膜容積比較無統計學差異(P>0.05)；內膜血流參數RI試驗組顯著低于對照組(P<0.05)，VFI試驗組顯著高于對照組(P<0.05)，而組間轉化后VI、FI及內膜下血流類型比較均無統計學差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組患者內膜轉化后第3天子宮內膜容積、血流參數比較[(-±s)，n(%)]

三、兩組患者妊娠結局比較

試驗組的胚胎種植率、臨床妊娠率均高于對照組，而早期流產率低于對照組，但差異均無統計學意義(P>0.05)(表5)。

表5 兩組患者HRT-FET結局比較[(-±s)，%]

討 論

胚胎著床是一個精細協調的事件，依賴于胚胎和子宮內膜之間的多成分雙向信號傳導[11]，成功的著床取決于胚胎質量、子宮內膜容受性和出色的移植技術[12]。RIF的病因非常復雜，一般涉及胚胎和子宮內膜相關因素。對于不明原因反復種植失敗(URIF)患者，被認為主要與子宮內膜容受性差有關[13]。

粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是一種造血系特異性細胞因子，以其對與細胞增殖相關的細胞內信號通路的激活的特異性作用而聞名。一些非造血細胞，如生殖組織細胞，也顯示產生G-CSF[14]。目前認為G-CSF在妊娠形成過程中具有多種生理作用，即促進胚胎卵裂和胚泡形成，通過影響子宮內膜相關基因的表達，調節子宮內膜血管重塑、局部免疫調節和細胞粘附途徑，從而改善內膜發育狀態及血流灌注[15]；促進子宮內膜增厚，改善子宮內膜異位癥的病理生理，從根本上減少妊娠損失，對傳統治療方法無反應的薄型內膜，G-CSF灌注可對其產生積極影響。一般認為在給藥后48～72 h，子宮內膜厚度明顯增加[7]。而G-CSF宮腔灌注通過藥物的外源性化學刺激及灌注操作本身的機械物理刺激，對多種內源性細胞因子的分泌起到了共同誘發的作用，從而影響子宮內膜的容受性及妊娠結局[8]，但仍需要更多臨床研究和循證醫學證據支持。

本試驗基于多篇關于G-CSF的國內外研究，選擇了擬行HRT-FET的URIF患者作為研究對象，進行宮腔灌注，并通過三維彩超測量子宮內膜厚度及子宮內膜血流等指標，比較治療后兩組患者的臨床結局。

研究結果顯示，內膜轉化后第3日試驗組A型內膜比例較對照組顯著增高(P<0.05)。一般認為A型內膜的臨床妊娠率高于B、C型，且A型內膜適合于胚胎著床的厚度范圍較大；也有學者認為內膜增生程度對妊娠率影響較小，內膜形態與妊娠結局無相關性，不足以評估臨床妊娠率[16]。

國內外學者就G-CSF對RIF病例的內膜厚度變化及臨床結局進行了大量的研究，但結論并不一致。在我們的研究中，G-CSF灌注對研究對象的子宮內膜厚度無明顯影響，G-CSF灌注組的胚胎種植率、妊娠率雖略高于對照組，流產率低于對照組，但差異均無統計學意義(P>0.05)。即使在大量嚴格隨機對照試驗(RCT)中，也只有大約一半得出G-CSF可以提高IVF治療后子宮內膜厚度、胚胎種植率或臨床妊娠率的結論，其他仍為陰性[17]。Kalem等[18]對157例新鮮移植的RIF患者進行了RCT，該研究剔除了內膜厚度<7 mm的薄型內膜患者，發現對子宮內膜正常的RIF患者宮腔內給予G-CSF干預，未明顯改變子宮內膜厚度、臨床妊娠率和活產率，本研究結論與之相似。Arefi等[19]采用皮下注射G-CSF的方式進行干預，得出了同樣的結論。Moustafa等[20]對于112例新鮮移植的RIF患者應用皮下注射G-CSF，發現子宮內膜厚度無明顯改變，而胚胎種植和活產率較未注射組亦未有所提高。Kunicki等[21]對62名常規治療無反應的行FET的子宮內膜薄患者隨機分組行G-CSF灌注治療，發現G-CSF輸注可改善子宮內膜厚度，但對臨床妊娠和活產率沒有任何改善。這些研究結果的不一致性可能是由于給藥途徑的差異以及研究對象之間臨床條件的異質性導致的。

在我們的研究中，內膜轉化前兩組的子宮內膜血流動力學比較無顯著差異，而內膜轉化后試驗組的RI低于對照組而VFI高于對照組(P<0.05)。子宮內膜及子宮內膜下血液灌注是胚胎著床的重要影響因素。當RI較低而VFI較高時，說明子宮內膜血流灌注良好，反之，說明血流灌注較差。有學者認為子宮動脈和螺旋動脈阻力增加，降低子宮內膜和子宮內膜下血流灌注，不利于胚胎著床，可能是導致RIF的原因之一，因此應盡量減少RIF患者的血流阻力，以改善妊娠率[22]。G-CSF對子宮內膜血管重構機制可能對血流阻力的減少起到一定作用。

大量的Meta分析對不同給藥途徑及不同條件的患者進行了更詳盡的分析。Zhang等[17]一項包括1 016 個IVF-ET周期的基于RCTs的Meta分析發現，G-CSF宮腔內灌注和皮下注射均可顯著提高臨床妊娠率，但對胚胎種植率無顯著影響。該研究又對受試者進行了亞組分析：針對RIF人群，G-CSF宮腔灌注后其臨床妊娠率和種植率均高于皮下注射組，雖然兩種給藥途徑均可提高IVF患者的臨床妊娠率，但針對RIF人群G-CSF宮腔內灌注同時提高了種植率。而Kamath等[23]一項納入15項RCTs共643名受試者的Meta分析顯示，G-CSF給藥可以提高RIF婦女的臨床妊娠率，但證據十分低質量(RR2.11，95%CI(1.56，2.85)；7 RCTs；受試者=643；I2=0%；低質量證據)。Li等[24]認為經陰道灌注G-CSF與更高的臨床妊娠率顯著相關，尤其是在亞洲人群中；在子宮內膜較薄或RIF患者中，G-CSF組的胚胎種植率和HCG陽性率顯著升高；然而，子宮內膜厚度的增加無統計學意義。Jiang等[9]一項納入11篇文章的Meta分析顯示，無論何種用藥方式，G-CSF對URIF患者的胚胎種植率和臨床妊娠率具有積極作用，皮下注射時效果更好，但沒有確鑿的證據表明G-CSF與流產率之間存在關聯。薄文嘉等[25]納入10個RCTs，研究G-CSF灌注治療RIF患者的臨床效果，結果顯示灌注組的臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于對照組，而流產率無統計學差異。另有研究表明，宮腔灌注G-CSF對RIF患者的胚胎種植率、臨床妊娠率及活產率均有顯著提高，且治療后宮腔液中的INF-γ、IL-17較治療前下降，而IL-10、TGF-β1及VEGF較治療前顯著上升，G-CSF可能改善患者的免疫狀態[26]。

綜上所述，G-CSF宮腔灌注對URIF患者的內膜容受性及臨床結局的影響仍存在著爭議。宮腔灌注治療具有無創性和經濟性的特點，若能夠驗證其效果，在臨床中利于推廣，這也為URIF患者的臨床治療提供了思路。本研究顯示G-CSF灌注對于URIF患者的子宮內膜厚度、妊娠結局并無顯著影響，說明該項技術對改善URIF患者的臨床結局證據不足。未來可繼續擴大樣本量，并采用亞組進一步分析，如薄型內膜組、全身G-CSF給藥組和不同G-CSF給藥劑量組等，使研究更有價值。另外在本研究中，未對胚胎進行胚胎種植前遺傳學檢測-非整倍體篩查(Preimplantation genetic testing for aneuploidies，PGT-A)，這是我們研究的另一個局限。總之，G-CSF對URIF患者子宮內膜及臨床結局的影響有待進一步研究。