無頭精子癥患者自然生育一例及文獻復習

王家雄，唐慧#，許詠樂#，郭宏，李紅，楊慎敏*，向菁菁*

(南京醫科大學附屬蘇州醫院 1.生殖與遺傳中心；2.司法鑒定中心，蘇州 215002)

精子在男性生育中的重要作用毋庸置疑，當出現結構異常時，精子的受精潛能會受到直接影響。受益于二代測序技術的發展，精子結構異常的遺傳病因被不斷揭示。比如，CFAP43和CFAP44的缺陷會導致精子鞭毛結構異常從而降低精子活動力[1]。此外，DPY19L2缺陷會導致頂體裝配異常從而影響精卵結合[2]。無頭精子癥(acephalic spermatozoa syndrome，ASS)是一類典型的精子結構異常，開始被稱為斷頭精子癥(decapitated sperm defect)[3-4]，表現為精子頭頸連接的缺陷[5]，由于其明顯的精子異常表型，吸引了許多研究者的關注。以往研究顯示SUN5(Sad1 and UNC84 domain containing 5[MIM：613942]) 缺陷是ASS最常見的遺傳病因[5-6]。除此之外，Zhu等[7]還在一對不育的兄弟中鑒定出另一個致病基因PMFBP1(polyamine modulated factor 1 binding protein 1[HGNC：17728，GenBank：NM_031293.2])。盡管ASS的病例發掘越來越多，但自然生育的病例還未見報道。本文報道一例已自然生育的SUN5缺陷病例。

病例資料

先證者和其家屬來自于我院生殖與遺傳中心，患者的外生殖器發育正常，雙側睪丸和激素水平正常，觸診未見雙側精索靜脈異常。該研究得到南京醫科大學附屬蘇州醫院倫理委員會的批準，患者及其家人簽署知情同意書。

一、診療鑒定過程

1.精液常規與精子形態分析：精液常規分析按照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗手冊(第五版)》進行，并檢測兩次。精子形態通過精子涂片、改良巴氏染色液染色，計數200個精子進行分析。形態缺陷根據之前的研究分為4類[7]：正常、不正常頭頸連接、斷頭(無頭精子附近可以找到對應精子頭部)、無頭，計算每個分類所占百分比。

2.掃描與透射電鏡：收集新鮮的精子樣本400g離心15 min，PBS清洗兩次，2.5% 戊二醛固定。經過脫水和滲透后，將樣本品包埋在Epon 812樹脂包埋劑(美國SPI)中，并用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對超薄切片進行染色。用透射電鏡(TECNAI-10，Philips，荷蘭)以80 kV的加速電壓觀察并記錄超微結構。用離子噴霧儀(ACE200，Leica，德國)噴射膠體金涂覆樣品，并用掃描電鏡(Nova NanoSEM 450，美國)以5 kV的加速電壓進行分析。

3.全外顯子測序、Sanger測序以及數據分析：基因組DNA通過QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)提取。使用至少3 μg患者DNA通過xGenExome research panel v1.0(Integrated DNA Technologies，美國)創建富集的DNA庫。經過生物信息學分析后，過濾并分析數據。考慮到表型和遺傳模式，發現SUN5的一個復合雜合突變。然后，直接進行Sanger測序以驗證推定的突變。通過聚合酶鏈反應(PCR)用引物擴增SUN5 exon11和exon13的序列。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，隨后通過ABI 3130遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)進行測序。引物序列見表1。

表1 Sanger測序引物序列

4.親子鑒定：使用AGCU EX20 STR試劑盒v1.0(無錫中德美聯生物)擴增患者及其女兒1 ng的DNA，其中包括牙釉基因和19個常染色體位點(即CSF1PO、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、，D7S820、，D8S1179、FGA、PentaD、PentaE、TH01、TPOX、vWA)。操作嚴格按照試劑盒中說明書進行。PCR后，在ABI 3130遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)上通過毛細管電泳分離擴增的產物，并使用Genemapper ID 3.2軟件(Applied Biosystems，美國)分析數據。

二、鑒定結果

1.SUN5缺陷患者精液檢查結果及精子形態學表型：患者的精子活動力低下，兩次檢測均未發現正常形態精子，異常頭頸連接、斷頭、無頭精子百分數值較高(表2)。光鏡下，與正常對照精子(圖1A)不同，患者的精子頭頸部交界處異常脆弱，導致許多精子只有孤立的頭或尾，呈現明顯的ASS表型，值得注意的是，雖然許多頸部存在異常，但仍然有完整的精子(圖1B)。掃描電鏡圖像顯示了斷裂的連接點(圖1D)，精子頭中段仍然處于連接狀態，卻出現嚴重畸形，如嚴重的成角彎曲(圖1E、F)，但精子的頭部形狀比較正常。在透射電鏡下，與正常精子(圖1G)不同的是，盡管近端中心體、節柱、線粒體和所有其他成分在尾部有序排列，ASS患者仍然缺乏完整的植入窩和基底板(圖1H)。

2.測序結果：測序深度和覆蓋范圍符合后續分析的條件，結合患者精子的頭頸連接缺陷，本研究發現SUN5中的兩個突變(c.781G>A[p.Val261Met]和c.1043A>T[p.Asn348Ile])，分別是Zhu等[5]在2016年和Shang等[8]在2018年以純合突變形式報道過的。Sanger測序結果證實了該患者的兩個變異，而患者女兒的c.1043A>T表明該患者為復合雜合子狀態(圖2)。

3.親子鑒定結果：患者的妻子經過8年備孕后自然受孕，并生育了一個女兒。親子鑒定結果顯示，父親和孩子的19個常染色體STR基因型，除vWA外，所有位點均符合孟德爾遺傳法，證明了他們之間的生物學親子關系(表3)。

表2 患者的精液質量參數

A：光鏡下正常精子形態(大框示小框區放大圖)；B：光鏡下ASS患者精子形態(大框示小框區放大圖)；C：正常精子掃描電鏡圖；D～F：ASS患者精子掃描電鏡圖；G：正常精子透射電鏡圖；H：ASS患者精子透射電鏡圖；箭頭所示為頭頸連接處。圖1 SUN5缺陷患者精子的形態學檢查圖像

箭頭示突變位點。圖2 患者及其女兒的Sanger測序分析結果

表3 患者和女兒的親子鑒定染色體匹配結果

討 論

ASS患者的精子存在結構異常，而SUN5是主要致病基因。多胺調節因子1結合蛋白1(polyamine modulated factor 1 binding protein 1，PMFBP1[GenBank：NM_031293.2])[7]、睪丸特異蛋白10(testis specific 10，TSGA10[MIM：607166])[9]、溴區結構域睪丸相關蛋白(bromodomain testis associated，BRDT[MIM：602144])[10]以及中心體蛋白112(centrosomal protein 112，CEP112[MIM：])[11]被鑒定與ASS有關，但后兩個基因沒有在其他人類患者中被檢測到或沒有被動物模型驗證。除此之外，在小鼠模型中有許多基因也被報道與ASS有關，如OAZ3[12]、CNTROB[13]、SPATA6[14]等等，但是這些突變都沒有在人類身上發現過。

SUN5也被稱為精子相關抗原4樣蛋白(sperm-associated antigen 4-like protein，SPAG4 L)，其編碼基因位于染色體20q11.21中，包含15個外顯子[15]。在精子細胞中，SUN5蛋白定位于精子核被膜的內膜上[6]。如果SUN5存在缺陷，頭頸偶聯裝置雖然可以很好地組裝，但是它不能連接到核被膜上，就好像吸盤本身沒有組裝問題，但無法吸附到目標上。SUN5蛋白包含兩種重要的結構域，分別是其N端的跨膜結構域和C端的保守SUN結構域[16]。本研究中的兩個突變均位于SUN5蛋白的C末端結構域，這是與偶聯裝置蛋白DnaJ熱激蛋白家族(Hsp40)成員B13(DnaJ heat shock protein family(Hsp40) member B13，DNAJB13)相互作用的關鍵功能域。DNAJB13是精子中與軸絲相關的成分，在精子發生過程中位于精子頭尾偶聯裝置中，SUN5的C末端結構域中的氨基酸變化可能會破壞SUN5蛋白與DNAJB13之間的相互作用，從而導致ASS[8]。

之前所有的研究均認為ASS是一種嚴重的原發不育，因為ASS患者沒有自然生育的報道，而卵胞漿內單精子注射(ICSI)被認為是幫助其成功孕育的唯一手段[17]。迄今為止，有4篇研究報道描述了SUN5突變導致的原發不育[5-6，8，17]，但只有一篇研究記錄顯示ICSI后的成功妊娠[17]。在本研究中，患者經過8年的嘗試，自然生育一個健康的女兒，這是攜帶SUN5致病突變的ASS患者首次自然生育的報道。因此我們認為之前報道顯示ASS患者ICSI結局良好，是由于SUN5缺陷僅僅只是破壞了精子頭尾之間耦合裝置的發生，對精子的頂體發生和核內遺傳完整性沒有影響[6]。本研究報道表明，盡管ASS患者自然生育存在很大困難，但并非沒有可能，這也預示著患有此類缺陷的ASS患者的輔助生殖妊娠結局和后代健康狀況應相當樂觀。

綜上所述，本中心接收到一例咨詢二胎生育的ASS患者，患者精子表現出典型的ASS表型，即頭頸連接異常，但值得注意的是部分精子頭頸并沒有完全斷開；通過全外顯子測序鑒定，發現患者是SUN5復合雜合突變(c.781G>A[p.Val261Met]和c.1043A>T[p.Asn348Ile])。患者第一胎的女兒為患者親生并攜帶c.1043A>T雜合突變，表明該患者為SUN5的復合雜合突變對蛋白質的影響小于純合突變，提示雖然SUN5缺陷將導致ASS，但對于輕度患者仍然有自然生育的機會。本研究為ASS患者的遺傳咨詢和輔助生殖治療提供了臨床參考，但需要進一步的分子功能機制研究來解釋由不同的SUN5突變類型引起的不同表型。