血小板反應蛋白-1在PCOS患者中對卵巢血流調控作用及其對人卵巢微血管內皮細胞增殖能力的影響

王宇欣，張婷，公丕東，田婷婷，劉寧，劉羽，王超，劉梅梅

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院婦產科，哈爾濱 150086)

多囊卵巢綜合征(PCOS)多見于青春期和生育年齡女性中，是下丘腦-垂體-卵巢軸激素失調的最常見疾病，無論是近期的臨床表現，還是遠期并發癥，都影響著女性的生理和心理健康。

血小板反應蛋白-1(TSP-1)是第一個被鑒定的天然血管生成抑制劑，作為一種細胞外基質，參與多種病理生理過程[1]。TSP-1具有多種功能，其特定結構域可匹配各種細胞表面受體，發揮多種生物學活性作用。TSP-1可阻斷大多數正調節血管生成的功能蛋白，并抑制依賴于生長因子的微血管內皮細胞(ECs)的增殖、遷移和形成管腔樣結構的能力[2]。

有研究發現，患有PCOS的女性的超聲下卵巢血流量顯著高于健康對照組，卵巢基質動脈搏動指數(PI)、阻力指數(RI)均低于對照組，且與高雄激素血癥顯著相關[3]。我們前期研究已證明，PCOS 女性卵泡期卵巢間質血供較健康女性明顯增多[4]。Tahergorabi等[5]發現PCOS女性血清TSP-1表達量較健康女性顯著降低。但是關于PCOS患者血清的TSP-1表達與卵巢間質血流的相關性研究較少，而TSP-1是否通過影響人卵巢微血管內皮細胞(HOMEC)的增殖而調控血管系統等，均尚不清楚。本研究擬探討PCOS患者血清中TSP-1的差異表達及其與卵巢血流的相關性分析，并通過體外實驗初步研究TSP-1對HOMEC細胞增殖的作用。

材料與方法

一、研究對象

選取2018年10月至2019年10月于我院就診的診斷為PCOS的女性共50例納入PCOS組，將同期因男性因素就診的非PCOS不孕女性50例納入對照組。

根據2003年的鹿特丹會議，PCOS的診斷標準[6]包括：(1)雄激素異常升高的臨床表現或性激素檢查中雄激素升高；(2)排卵頻率降低或無排卵；(3)卵巢多囊形態，即單或兩側卵巢中存在數目增多(≥12個)、特定直徑范圍(2～9 mm)的卵泡，或卵巢體積增大(>10 cm3)。具備以上2項或以上，同時排除其他導致雄激素異常升高的疾病。

對照組納入標準：生育年齡的健康女性，月經頻率正常，無高雄激素臨床表現；內分泌激素水平正常，超聲顯示子宮、雙側卵巢均無異常形態改變，超聲顯示無其他盆腔病變。

所有參與者需排除：妊娠、高泌乳素血癥、甲狀腺和腎上腺疾病、全身性疾病如高血壓和糖尿病等；近期(6個月內)應用激素藥物。

本研究經本院倫理委員會批準，參與者已簽署知情同意書，在本院生殖中心開展。

二、主要試劑

HOMEC和內皮細胞培養基(ECM)(上海中喬新舟)；0.25%胰酶消化液(上海碧云天)；TSP-1(Origen，美國)；細胞增殖及毒性檢測試劑盒(CCK-8，大連美侖生物)；人TSP-1 ELISA試劑盒(Thermo Fisher，芬蘭)。

三、研究方法

1.性激素測定：于卵泡早期(月經周期第2～4天)，空腹12 h或以上，上午8～10時，抽取外周靜脈血進行性激素檢查；若閉經2個月以上的參與者，超聲顯示無優勢卵泡，也可進行性激素檢查。性激素項目包括卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)和睪酮(T)。所有檢測均采用電化學發光免疫分析法測定。余下血清置于-20 ℃冰箱中備用。本研究中T>1.67 nmol/L界定為高雄激素血癥。

2.血清TSP-1水平檢測：采用ELISA法，按試劑盒說明操作，檢測上述備用血清中TSP-1表達水平。

3.卵巢間質血流的測定：于采血當日上午8～10時，使用陰道彩色多普勒超聲儀對所有受試者完成下述檢查：同一操作者，在未知參與者激素水平的情況下，測量參與者的左、右卵巢間質血流，計算并記錄卵巢PI和RI。重復測量3次取平均值。

4.體外實驗細胞培養：常規培養HOMEC，使用完全ECM培養基，條件為37℃、5%CO2的恒溫培養箱，24～36 h換液。待細胞融合度達80%～90%后，吸取適量37℃預熱的0.25%胰蛋白酶完成消化操作，傳代培養。為保證細胞活力，取第3～5代HOMEC進行后續操作。

5.CCK-8法檢測細胞增殖活力：以5×103個/孔將HOMEC接種到96孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。棄培養液，實驗孔分別加入含有濃度為10-11mmol/L、10-10mmol/L、10-9mmol/L TSP-1的完全ECM，對照孔加入等量完全ECM，空白孔內不含細胞并加入等量完全ECM。常規條件培養12 h、24 h、48 h后，每孔注入CCK-8增強型溶液10 μl。培養箱中培養0.5～1 h，測定450 nm吸光度(OD值)。每組設置6個重復孔。計算公式：抑制率=(對照孔OD值-實驗孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

四、統計學分析

結 果

一、兩組患者性激素、TSP-1水平及卵巢間質血流動力學參數比較

PCOS組的FSH、E2水平與對照組相比，差異無統計學意義(P>0. 05)，而PCOS組的LH、T及LH/FSH均顯著高于對照組(P<0. 05)。與對照組相比，PCOS組TSP-1水平顯著降低(P<0.05)，卵巢間質血流動力學參數RI、PI值均顯著降低(P<0.05)(表 1、圖1)。

表1 兩組患者性激素、TSP-1水平及卵巢血流參數比較(-±s)

圖1 陰道超聲檢測卵巢間質血流圖

二、PCOS組卵巢間質血流參數RI、PI值與TSP-1的相關性分析

Pearson相關性分析顯示，TSP-1與RI呈顯著正相關(r=0.83，P<0.05)(圖2A)，TSP-1與PI亦呈顯著正相關(r=0.85，P<0.05)(圖2B)。

三、TSP-1對HOMEC活力的影響

研究結果顯示，與對照組相比，10-11mmol/L TSP-1組、10-10mmol/L TSP-1組，10-9mmol/L TSP-1組作用12 h、24 h、48 h后，細胞抑制率均顯著升高(P均<0.05)(表2)，提示TSP-1抑制HOMEC增殖。在TSP-1作用12 h、24 h、48 h，TSP-1對HOMEC的抑制作用隨濃度升高而增強(P<0.05)；在不同濃度TSP-1組(10-11mmol/L、10-10mmol/L、10-9mmol/L)中，與TSP-1作用12 h相比，TSP-1作用24 h、48 h的細胞抑制率均顯著升高(P<0.05)(表2，圖3)，在24 h時達到峰值。

圖2 PCOS組卵巢間質血流參數RI、PI值與TSP-1的相關性分析

表2 各濃度TSP-1作用不同時間對HOMEC活力的抑制效果(-±s)

與同時間點10-11 mmol/L組比較，*P<0.05。圖3 不同濃度TSP-1作用不同時間對HOMEC的抑制率

討 論

PCOS是下丘腦-垂體-卵巢軸激素失調的最常見疾病，以排卵障礙，超聲影像提示卵巢多囊形態，臨床表現雄激素異常升高為特征，通常伴有肥胖、胰島素抵抗、血脂升高和不孕，遠期可并發心血管疾病和代謝綜合征等，其病因尚不清楚[7]。卵巢毛細血管網支持卵泡發育和黃體形成，卵巢血供具波動性，該波動情況與卵泡生長情況、內分泌水平相一致。研究發現PCOS患者超聲下顯示卵巢間質血流增多、頻譜為高速低阻[4]；測量卵巢間質動脈參數，發現PCOS患者RI、PI值的顯著降低，即卵巢間質血流較正常女性顯著增多[8]。

TSP-1是首先被鑒定的體內來源的負性調節血管生成的蛋白[1]。TSP-1可以拮抗血管內皮生長因子(VEGF)的活性來減少血管生成，結合CD36、CD47和整合素發揮功能[9]。在過表達TSP-1的裸鼠異種移植瘤中，微血管密度降低[10]。在微血管ECs中，TSP-1與CD36的Clesh結構域匹配，進而激活下游的Src家族通路，誘導ECs凋亡[11]。

Tahergorabi等[5]研究發現，PCOS患者的血清TSP-1水平較健康對照者顯著下降，且隨著PCOS婦女的體質量指數(BMI)的增高而呈進一步下降趨勢。在動物實驗模型中，PCOS大鼠的卵巢體積和質量明顯增大，卵巢中的TSP-1蛋白含量下降[12]。本研究結果顯示，在PCOS患者中，血清TSP-1含量下降，且超聲顯示卵巢動脈RI、PI降低。RI、PI是反映卵巢動脈血流阻力的血流動力學參數，其指標降低表明卵巢血流的灌注更加豐富。同時，我們發現TSP-1表達水平與RI、PI具有正相關性，提示PCOS患者卵巢血流量的改變與TSP-1的表達可能具有一定的相關性。

以往關于TSP-1對血管系統的研究均集中在腫瘤血管[13]、皮膚傷口愈合過程中的血管生成、成纖維細胞[14]等，對卵巢微血管內皮細胞(HOMEC)的研究報道卻很缺乏。血管ECs種類繁多，性質復雜，對不同刺激的反應性不同，如人臍靜脈ECs和人主動脈ECs對TSP-1的不同反應，TSP-1抑制人主動脈ECs中VEGF的表達水平，卻不能抑制人臍靜脈ECs中VEGF的表達水平[15]。在PCOS患者中TSP-1影響卵巢血流的具體機制尚不明確。因此，我們通過CCK-8實驗來研究TSP-1對HOMEC增殖的影響。在本實驗中，通過CCK-8實驗發現TSP-1可顯著抑制HOMEC的細胞增殖活力，且細胞抑制率隨著TSP-1濃度的增加而增加，在10-9mmol/L～10-11mmol/L濃度范圍內呈濃度依賴性抑制；而在同一藥物濃度下，隨著時間的增加，TSP-1對HOMEC的抑制率先增加，在作用24 h時達到峰值，隨后下降，但在作用48 h時仍高于12 h時。TSP-1對于HOMEC增殖活力的抑制作用在12～24 h內有著時間依賴性，24 h之后的抑制作用下降可能與細胞代謝TSP-1有關。

綜上所述，本研究發現在PCOS患者血清中TSP-1表達降低，超聲顯示卵巢間質血流量豐富，卵巢間質血流參數RI、PI值顯著降低，且TSP-1表達水平與RI、PI值呈現正相關；此外，體外實驗發現TSP-1可以抑制HOMEC的增殖。提示PCOS患者卵巢間質血流增多可能來自于抑制HOMEC增殖的TSP-1的低表達。本研究從血管生成方面初步探究了TSP-1對HOMEC的作用；不足之處在于本實驗中選取的HOMEC為健康細胞系，而不是從PCOS模型中分離提取、原代培養的細胞。在進一步的研究中我們擬從PCOS大鼠卵巢中提取原代HOMEC做更深入的研究。此外，TSP-1在PCOS中抑制HOMEC增殖的具體分子調控機制需要我們進一步研究。