基于AMPK信號通路研究LPS對奶牛乳腺上皮細胞脂代謝的調控機理

李林，李建嫄，趙梅，唐偉斌

(1. 邢臺學院生物科學與工程學院，河北 邢臺 054001；2. 河北醫科大學附屬邢臺人民醫院病理科，河北 邢臺 054001)

隨著人們生活水平的提高，乳加工產品越來越受到人們的重視，奶業也因此迎來了發展的黃金期。但是由于我國目前缺乏大面積的優質牧場，因此反芻動物在泌乳高峰期間，商家為了滿足其對高能量的需要通常向日糧中增加精料比例[1-2]。當日糧中的精料比例大于60%時，就稱為高精料飼喂。在高精料日糧中，由于有效纖維含量有限，所以反芻動物在咀嚼的時候唾液分泌量就會大大減少，導致瘤胃中的胃酸不能及時被稀釋，加之高精料極易導致瘤胃發酵異常，因此，高精料飼喂往往會造成機體的亞急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis，SARA)[3]。SARA的發生會導致瘤胃中代謝異常產物脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等的大量釋放，嚴重還會導致乳腺炎、蹄葉炎甚至死亡等現象發生[4-6]。

反芻動物乳腺感染外源或內源性的LPS，通常是由于環境或飲食所造成的，LPS的產生可以觸發機體產生免疫應答[7-9]。Chang等[10]研究發現，高精料誘導的奶牛機體出現的SARA癥狀及血液LPS升高，會造成乳腺脂肪酸合成受阻，而脂肪酸是乳脂的重要組成部分。腺苷酸活化激酶(AMPK)作為一個“傳感器”可“調節”細胞中的能量。AMPK信號通路在脂質代謝中起著重要作用，激活AMPK可以抑制脂質合成。

目前，該方面的研究多集中在奶牛的體內試驗，而在體外的乳腺細胞及具體機理方面的研究相對較少。因此，本試驗利用奶牛乳腺上皮細胞作為模型，通過向細胞中添加不同濃度的LPS，觀察細胞的存活力、炎癥因子及探討調控乳脂合成的具體信號機制，旨在為養殖實踐中奶牛乳腺炎的防治及乳品質的提高提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 奶牛乳腺上皮細胞系

奶牛乳腺上皮細胞系MAC-T由南京農業大學張源淑教授饋贈。

1.2 MAC-T細胞的培養和傳代

MAC-T細胞在DMEM培養基中進行培養，內含10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素/鏈霉素和4.5 g/L葡萄糖，置于含5% CO2的恒溫培養箱(37 ℃)中培養，根據細胞生長狀態，及時更換新鮮培養基，每隔2～3 d將細胞重新傳代1次。當細胞融合度達到80%～90%時，用貼壁細胞用消化液(含0.25%胰酶、0.02% EDTA)進行消化處理，1 500 r/min離心5 min，小心棄掉上清，分別將細胞接種于6孔板、12孔板以及96孔板中，分別加入新鮮培養基，置于恒溫培養箱中培養。

1.3 LPS誘導MAC-T細胞損傷模型的建立

1.3.1 LPS誘導細胞損傷試驗

接種于96孔板內的MAC-T細胞，融合度達到70%～80%時棄去培養液。PBS洗滌后，分別加入含有不同濃度LPS的無血清培養基(LPS濃度分別為0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL、10 000 ng/mL)；在5% CO2恒溫培養箱(37 ℃)中分別培養1、3、6、9、12 h。每組設置10個平行孔。

1.3.2 乳腺上皮細胞MTT試驗

當各組細胞按上述處理完成后，96孔板內更換新鮮無血清培養液，并在每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液(購自上海碧興天生物技術有限公司)，在5% CO2的恒溫培養箱(37 ℃)繼續培養4 h后，將上清棄去，每孔分別加入150 μL DMSO溶液，微量振蕩器振蕩，于RT-6000半自動生化分析儀上檢測各孔490 nm處的吸光度值。

1.4 MAC-T細胞炎癥因子檢測

將12孔板中的MAC-T細胞融合度達到70%～80%時，棄去培養液。PBS洗滌后，分別加入含有不同濃度的LPS(0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL、10 000 ng/mL)無血清培養基；在5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中分別培養9 h，每組設置6個平行孔。收集細胞用超聲波細胞破碎儀進行破碎，4 °C，2 500 r/min離心10 min，取上清。分別檢測不同組細胞腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)的含量，操作步驟按照說明書進行。細胞因子檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5 MAC-T細胞甘油三酯(TG)含量檢測

MAC-T細胞與不同濃度的LPS孵育，9 h后收集MAC-T細胞，超聲波處理器進行細胞破碎處理，4 ℃，2 500 r/min離心10 min，取上清。用甘油三酯檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)測定甘油三酯含量。

1.6 Western blot分析MAC-T細胞AMPK通路蛋白

將細胞用含1% AMPK蛋白酶抑制劑(購自上海藍木化工有限公司)的裂解緩沖液處理5 min。然后將勻漿液以12 000 r/min速度離心，4 ℃條件下離心10 min。用蛋白檢測試劑盒測定蛋白質濃度。用聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質。然后轉移至PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后將一抗AMPK-兔和p-AMPK-兔(購自艾博抗上海貿易有限公司)1∶5 000 稀釋。4 ℃，雜交過夜，與相應的二抗辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(H+L)(購自上海碧云天生物技術有限公司)，共同孵育1 h，用ECL發光液進行Western blot圖像處理。用Image Lab 6.0分析條帶灰度值。

1.7 MAC-T細胞脂代謝相關關鍵酶的表達

MAC-T細胞與不同濃度的LPS孵育9 h后收集MAC-T細胞，將收集的細胞采用TRIzol法直接提取總RNA，利用BioPhotometer測定樣品總RNA濃度，分析OD260/OD280值，判斷提取總RNA的純度，OD260/OD280需要在1.8～2.0范圍之內。取1 μg總RNA進行反轉錄得到cDNA，詳細操作步驟參照說明書進行。

根據GenBank上牛的乙酰CoA羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(SCD-1)、脂肪酸移位酶(CD36)及β-actin內參基因引物，參照GenBank序列，用Primer Premier 5軟件自行設計，設計完成后交由上海Sangon公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因及β-Actin引物序列

1.8 AMPK抑制劑對MAC-T細胞TG含量的影響

當MAC-T細胞融合度達到70%～80%時，棄去培養液。試驗分為3組，分別為對照組、LPS處理組(1 000 ng/mL)、AMPK抑制劑組(10 μmol/L BML-275+1 000 ng/mL LPS)，在5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中分別培養9 h后，收集MAC-T細胞，超聲波處理器進行細胞破碎處理，4 ℃，2 500 r/min離心10 min，取上清。用甘油三酯檢測試劑盒測定甘油三酯含量。

1.9 AMPK抑制劑對MAC-T細胞脂代謝相關關鍵基因的影響

將上述3組細胞分別進行培養9 h后，收集MAC-T細胞，將收集的細胞采用TRIzol法直接提取總RNA，然后通過反轉錄得到cDNA，詳細操作步驟參照說明書進行。

1.10 統計與分析

數據均以“平均值±標準差”表示，MTT法通過采用SPSS 19.0(SPSS，USA)統計軟件進行獨立樣本t檢驗分析，其他試驗結果進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用LSD法進行多重比較，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 LPS對MAC-T細胞相對活力的影響

試驗結果表明，從6 h開始經不同濃度的LPS處理后MAC-T細胞的相對活力開始下降，其中在1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS的處理下細胞的相對活力顯著低于對照組(P<0.05)；從9 h開始，1 000 ng/mL和10 000 ng /mL LPS的處理下，細胞相對活力極顯著低于對照組(P<0.01)(圖1)。根據檢測結果，確定LPS誘導MAC-T細胞炎性損傷最佳刺激時間為9 h。

與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)圖1 LPS對MAC-T細胞相對活力的影響(n=10)

2.2 LPS對MAC-T細胞炎癥因子的影響

如表2所示，用1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，與對照組相比，MAC-T細胞中TNF-α和IL-8含量顯著上升(P<0.05)；而用10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，與對照組相比，細胞內的IL-6含量顯著上升(P<0.05)。

表2 LPS對MAC-T細胞炎癥因子指標的影響 μg/L

2.3 LPS對MAC-T細胞TG的影響

如圖2所示，與對照組相比，用100 ng/mL、1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細胞內TG含量顯著下降(P<0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同圖2 LPS對MAC-T細胞TG含量的影響

2.4 LPS對MAC-T細胞AMPK信號通路的影響

檢測細胞內的AMPK蛋白水平，結果如圖3所示。用1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，細胞內P-AMPK水平與對照組相比顯著升高(P<0.05)。

圖3 P-AMPK蛋白含量的檢測

2.5 LPS對MAC-T細胞脂代謝相關酶mRNA表達的影響

通過對MAC-T細胞脂肪酸激活、轉運、合成關鍵酶mRNA水平的檢測。結果由圖4所示，與對照組相比，用100 ng/mL、1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，與ACC、SCD-1的相關基因顯著降低(P<0.05)；在1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，FAS基因也顯著降低(P<0.05)。提示：LPS會影響MAC-T細胞脂肪酸的從頭合成及TG含量，進而影響乳脂的生成。

A. ACC；B. SCD-1；C. FAS；D. CD36圖4 LPS對MAC-T細胞脂代謝相關基因的影響

2.6 AMPK抑制劑對MAC-T細胞TG含量的影響

向細胞中添加AMPK抑制劑BML-275后，各組MAC-T細胞TG含量測定結果見圖5。LPS處理組中TG含量顯著下降(P<0.05)，而AMPK抑制劑組中TG含量與LPS處理組有上升的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

圖5 AMPK抑制劑對MAC-T細胞TG含量的影響

2.7 AMPK抑制劑對MAC-T細胞脂代謝相關酶mRNA表達的影響

向MAC-T細胞添加AMPK抑制劑BML-275后，MAC-T細胞脂代謝的相關酶mRNA表達水平的測定結果見圖6。用1 000 ng/mL LPS刺激9 h后，與對照組相比，ACC(圖6A)、FAS(圖6B)、SCD-1(圖6C)的相關基因顯著降低(P<0.05)；而向細胞中加入BML-275后，與LPS處理組相比，上述基因顯著上升(P<0.05)。經過LPS處理后CD36基因表達差異不顯著(P>0.05)，圖6D。

A. ACC; B. FAS; C. SCD-1; D. CD36圖6 AMPK抑制劑對MAC-T細胞脂代謝的影響

3 討論

3.1 LPS對MAC-T細胞活性及炎癥指標的影響

泌乳期的高產奶牛，養殖戶為了彌補其能量不足，往往就會逐漸增加飼料中的精料比。然而，大量飼喂高精料日糧會導致瘤胃快速發酵，瘤胃中的揮發性脂肪酸和乳酸水平升高就會導致氫離子增加，從而導致pH值降低。pH值的降低改變了瘤胃微生物群，殺死了革蘭陰性菌，導致大量LPS從死亡細胞表面釋放出來進入血液[12-13]。

LPS經過血液的體循環后引發機體的炎癥，同時也會進入乳腺引發泌乳功能出現障礙。Guo等[14]通過高精料飼喂泌乳期奶牛1個月后，發現瘤胃及血液中LPS含量顯著升高，并且造成了機體的SARA。Chang等[15]研究發現，高精料飼喂不僅導致了奶牛機體的SARA，同時瘤胃所產生的大量LPS進入血液后通過乳動脈流入乳腺，造成了奶牛的乳腺炎、影響了乳蛋白的合成。Memon等[16]研究發現，精粗比為6∶4的日糧會造成奶牛機體SARA的產生，并且在乳腺組織中會激活與炎癥相關的信號通路。實驗證明，高精料飼喂泌乳奶牛，會通過NF-κB信號通路激活核苷酸結合寡聚體結構域蛋白1進而引發乳腺的炎癥反應，使乳腺中炎癥因子上升[17]。白介素和腫瘤壞死因子是參與調節免疫反應、造血和炎癥反應的典型的多功能細胞因子，它們的功能廣泛重疊，但各有其獨特的特性。其中，IL‐6具有調節免疫系統和神經系統的功能[18]；TNF-α是細胞凋亡、炎癥和免疫的主要中介因子，它與疾病的發病機制有關，包括敗血癥、糖尿病、癌癥[19-20]。本試驗通過體外細胞研究發現，用不同濃度的LPS分別刺激MAC-T細胞發現，1 000 ng /mL LPS和10 000 ng/mL LPS的處理下細胞相對存活率從6 h開始顯著下降，在9 h和12 h的時候下降極顯著。提示，隨著時間的延長和LPS濃度的升高，會造成MAC-T細胞存活率下降。進一步檢測與細胞氧化應激的相關指標，發現1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細胞中IL-8和TNF-α含量顯著上升；而用10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，細胞內的IL-6含量顯著上升。提示，LPS不僅造成了細胞的炎癥狀態，同時也使更多的細胞發生了非正常凋亡。

3.2 LPS對MAC-T細胞脂合成代謝及相關通路的影響

乳脂肪主要是由TG(含量為97%)、膽固醇等營養成分組成[11]。研究發現，當乳腺處于炎癥狀態時，用于合成乳脂肪的前體物就會減少，進而導致乳中乳脂肪含量降低[21]。TG中的脂肪酸組成與飼糧中脂肪酸、飼糧碳水化合物/脂質比和種屬都有關。乳中的TG通常有3種來源:乳腺從頭合成、膳食脂類和內源性脂肪儲存(脂肪或肝脂類)。在反芻動物中，乳腺乳脂肪的從頭合成途徑對TG合成具有重要作用，乳腺的從頭合成途徑是一個極其復雜的過程。該過程需要一系列相關酶類的調節。其中ACC在大多數生物體內的脂肪酸代謝中起著關鍵的作用，它通過生物素羧化酶和羧基轉移酶兩種催化活性，催化乙酰輔酶A的羧化生成丙二酰單酰輔酶A[22-24]。SCD是調節飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉化的主要酶，也是調節肥胖基因代謝途徑的主要成分[25]。研究發現哺乳動物在泌乳期間，乳腺上皮細胞中與脂肪酸合成的關鍵酶，ACC等都會顯著上調[26]。AMPK是真核生物細胞和機體代謝的中樞調節因子之一，當細胞內ATP產生減少時，AMPK就會被激活。AMPK在調節生長和機體代謝方面起著關鍵作用[27-28]。本研究發現，AMPK的磷酸化會增加組織中葡萄糖攝取、脂肪酸氧化。本試驗中，用100 ng/mL、1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細胞中脂肪總含量及TG含量顯著下降。進一步通過分析與脂代謝相關的關鍵通路蛋白及關鍵酶，發現1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細胞中P-AMPK蛋白表達量顯著上升；100 ng/mL、1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細胞中ACC、SCD-1含量顯著下降，并且1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激后，其FAS含量也出現顯著下調。此外，通過向細胞中添加AMPK抑制劑(BML-275)，發現LPS組TG含量與對照組相比顯著下降，而AMPK抑制劑組TG含量有上升趨勢，但差異不顯著。通過對與脂代謝相關的關鍵酶分析，發現與對照組相比，ACC、FAS、SCD-1的相關基因顯著降低；而向細胞中加入BML-275后，AMPK抑制劑組與LPS處理組相比，ACC、FAS、SCD-1相關基因顯著上升。提示：LPS造成了MAC-T細胞TG含量的下降，并且影響了脂代謝合成途徑，導致TG含量下降，影響了乳脂肪的合成。

綜上，本研究結果發現，通過向MAC-T細胞中添加LPS，不僅造成了細胞的活性下降，還導致了細胞炎癥；LPS通過AMPK信號通路造成了MAC-T細胞脂合成代謝關鍵基因活性下降，TG的合成能力下降。分析其原因，可能是由于在炎癥狀態下，MAC-T細胞首先將胞內物質經過轉化后用于抵抗細胞的應激狀態，而消耗了大量的乳脂前體物用于機體供能，進而通過AMPK信號通路影響乳脂合成。