谷子光敏色素家族基因的生物信息學及表達模式分析

申慧敏，吳年隆，王亞敏，王興春

（1.山西農業大學生命科學學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學基礎部，山西 太谷 030801）

光在植物生長發育各個階段起重要的調控作用，植物中諸如種子萌發、向光性生長、光呼吸和光合作用等生理生化現象都與其密切相關。植物通過光受體感知光信號，通過信號轉導，調節基因表達，控制細胞分裂、分化與生長，最終調控器官發育和形態建成，其中，光受體在這個過程中起重要調節作用[1]。光敏色素是一類能吸收紅光與遠紅光，且可相互轉化的色素蛋白，可分為光不穩定型的類型Ⅰ光敏色素（typeⅠphytochrome，PⅠ）和光穩定型的類型Ⅱ光敏色素（typeⅡphytochrome，PⅡ），無論是單子葉植物還是雙子葉植物，PⅠ由PHYA編碼，PⅡ由非PHYA的光敏色素基因編碼[2]。研究表明，光敏色素與植物的避陰反應和抽穗開花期相關，此外，光敏色素還參與了形態建成、誘導多種酶的合成、植物激素代謝等生理過程[3-5]。

光敏色素存在植物的各個組織中，生理作用廣泛，調節植物從生長發育到衰老的形態建成。近年來，光敏色素的功能相繼被解析出來。啟動光敏色素信號的第1 步是通過PHYA 感知遠紅光或PHYB-PHYE 感知紅光來改變Pr 和Pfr 的構象，光活化后，光敏色素從細胞質轉移至細胞核[6-7]。激活后的光敏色素復合體與下游作用因子PIFs 和COP1-SPA相互作用[8]。PIFs是bHLH轉錄因子，在光敏色素介導的信號網絡中起樞紐作用[9]，光敏色素與核內的PIFs 相互作用，誘導PIFs 磷酸化，并通過泛素26S 蛋白酶降解蛋白，因此，光敏色素通過降解光形態發生的負調控因子PIFs 來介導光形態發育[10]。此外，KOZUKA等[11]研究發現，光敏色素通過協調油體脂質的降解及其代謝產物糖的產生，參與去黃化過程中子葉變綠過程，在植物去黃化過程中起到關鍵作用。LI 等[12]研究發現，玉米中的ZMPYC1和ZMPYC2基因可調控植株開花時間和株型結構，為耐密玉米品種的選育提供了新思路和理論基礎。XIN 等[13]研究發現，光敏色素信號（SFPS）剪接因子能與光受體光敏色素B 直接相互作用響應光信號，通過調控光信號AAA 傳導和晝夜節律基因mRNA 前體的剪接來調節光介導的植物發育過程。

谷子（Setaria italica）是世界上最古老的馴化作物之一，與其他作物相比，其具有許多優良性狀，包括抗旱、耐貧瘠，C4高光效，在旱作可持續生態農業建設中具有重要作用[14-16]。然而，鮮見有關對SiPHY基因家族成員及功能的研究報道。

本研究利用生物信息學方法鑒定分析谷子中PHY基因家族成員及其在不同光周期條件下的表達模式，有助于研究光敏色素與谷子光敏感性間的關系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料有野生型晉谷21、黃粟、大同紅谷和早熟突變體xiaomi（晉谷21 的EMS 誘變突變體）、xiaomi3（黃粟的自然誘變突變體）、xiaomi4（大同紅谷的自然誘變突變體）。

1.2 試驗方法

1.2.1SiPHY基因家族序列鑒定及理化性質分析從擬南芥（Arabidopsis thaliana）數據庫TAIR（https://www.arabidopsis.org/）中獲得5個PHY家族成員（At-PHY）的蛋白序列，在Phytozome 數據庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中下載水稻、高粱、玉米和狗尾草的基因組數據，在谷子多組學數據庫（http://sky.sxau.edu.cn/MDSi.htm）下載谷子xiaomi的基因組數據。利用擬南芥AtPHY 蛋白序列通過Bio Edit 軟件中的Local BLAST 程序篩選xiaomi、水稻、高粱、玉米和狗尾草的PHY 蛋白序列，篩選不穩定條件為E-value＜10e-10，并利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）進行結構域驗證。最后利用在線網站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）對谷子SiPHY 蛋白的氨基酸數目、分子質量、等電點（PI）、不穩定系數和脂肪系數等理化性質進行預測。

1.2.2SiPHY基因家族進化分析 將1.2.1 中篩選鑒定到的谷子、擬南芥、水稻、高粱、玉米和狗尾草的PHY基因，利用MEGA 7.0 軟件中的Align By Muscle 程序對6 種不同物種的PHY 家族成員的蛋白序列進行多序列比對，并采用鄰接法（NJ）構建系統進化樹，Bootstrap參數設置為1 000。

1.2.3SiPHY基因家族的保守結構域和基因結構分析 使用在線網站MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）預測谷子SiPHY基因的保守基序，Motif數目設置為10，然后利用TBtools 繪制xiaomiPHY家族基因的基因結構和保守基序圖。

1.2.4SiPHY啟動子順式作用元件分析 在谷子多組學數據庫下載谷子PHY 家族各成員的上游2 000 bp 的基因組序列，然后遞交至在線網站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子順式作用元件分析；最后利用TBtools 對整理后的功能元件進行可視化操作。

1.2.5 不同光周期下SiPHY基因的表達模式分析利用谷子多組學數據庫中的Expression Visualization 工具獲取SiPHY基因的表達量及熱圖，并對其表達譜進行分析。為進一步研究在不同光周期條件下SiPHY基因的表達情況，本研究選用在長日照條件（16 h 光照，28 ℃/8 h 黑暗，22 ℃）和短日照條件（10 h 光照，14 ℃/8 h 黑暗，22 ℃）生長30 d 的野生型晉谷21、黃粟、大同紅谷和早熟突變體xiaomi、xiaomi3、xiaomi4的新生葉，用熒光定量PCR（qRTPCR）的方法檢測SiPHY基因的表達量。材料種植于恒溫培養箱中，光照強度設置為30 000 lx，濕度設置為50%，每7 d澆一次B5營養液。

采用Omega 植物RNA 提取試劑盒R6827-01提取6個品種新生葉片的RNA，采用寶日醫生物技術（北京）有限公司的反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit（貨號RR047A）合成cDNA 第一鏈，TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（貨號RR820A）進行實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR），3次生物學重復。15 μL反應體系包括：7.5 μL 2×Taq PCR Master Mix（含熒光染料）、10 μmol/L 上下游引物各0.6 μL、3.3 μL ddH2O 和3 μL cDNA模板。反應條件為：95 ℃2 min；95 ℃5 s，60 ℃30 s，39 個循環。RT-qPCR 引物序列信息如表1 所示。以內參基因Si9g37480為對照，該基因在谷子的11個組織中表達量穩定。利用公式2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

表1 SiPHY實時熒光定量PCR分析引物Tab.1 SiPHY real-time fluorescence quantitative PCR analyze primers

1.3 數據分析

利用BioRad CFX Manager 軟件將4個SiPHY基因的RT-qPCR 數據導入到Excel，將重復性差的數據刪除，計算出各基因的平均Cq值和相對表達量，將數據整理后采用SPSS 軟件進行分析，并在Excel中作圖。

2 結果與分析

2.1 SiPHY基因家族的鑒定及其理化性質分析

通過同源序列比對，在谷子xiaomi的PHY家族基因包含4個基因，分別命名為：SiPHY-1、SiPHY-2、SiPHY-3和SiPHY-4，均包含PHY（PF00360）、PAS（PF00989）和GAF（PF01590）結構域，其中，PAS 和GAF形成光感受中心，能夠調節發色團的裝配和改變突變蛋白的光譜特性[17]，PHY結構域在調節光敏色素Pfr 形態穩定性的微調和保證正確的光譜特性、核定位、激酶活性具有重要意義[18-19]。SiPHY-1、SiPHY-3和SiPHY-4分布在9號染色體上，SiPHY-2分布在8號染色體上；cDNA長度為2 373～3 519 bp，編碼790～1 172個氨基酸；分子質量在87 118.83～128 453.27 u，等電點在5.81～6.27，除SiPHY-2 外，其余3 個成員親水性（GRAVY）均為負數，表明它們均屬于酸性親水性蛋白（表2）。

表2 SiPHY基因家族成員基本信息Tab.2 Basic information of SiPHY gene family members

2.2 谷子、水稻、擬南芥、高粱、玉米和狗尾草PHY家族基因的進化分析

為研究谷子SiPHY的進化關系，將擬南芥（5個）和水稻（3個）、高粱（3個）、狗尾草（3個）、玉米（6個）以及谷子（4個）PHY 家族基因構建系統進化樹，結果如圖1 所示，4 個SiPHY 分別屬于PHYA、PHYB、PHYC 等3個亞族，其中，SiPHY-1和SiPHY-2屬于PHYA 亞族，SiPHY-3 屬于PHYB 亞族，SiPHY-4 屬于PHYC 亞族，且PHYA 亞族聚為一支，PHYB 和PHYC 聚在一起。結果表明，谷子SiPHY 與狗尾草SvPHY、高粱SbPHY、玉米ZmPHY、水稻OsPHY 的親緣關系近于與擬南芥AtPHY 的親緣關系。這可能是因為谷子、狗尾草、水稻、高粱、玉米是單子葉禾本科植物，而擬南芥屬于雙子葉十字花科植物，推測植物在進化過程中PHY基因發生了生物學功能分化。

2.3 SiPHY基因家族的保守域和基因結構分析

為進一步了解谷子SiPHY家族成員的功能，對谷子SiPHY家族基因成員進行保守結構域和基因結構分析，結果如圖2所示，SiPHY家族成員被分為2 個亞族，4 個SiPHY基因均為斷裂基因，且基因結構均存在一定的差異。SiPHY-1和SiPHY-3含有5′端非翻譯區和3′端非翻譯區。SiPHY-4中間存在一段較長的內含子區域，可能在谷子生長發育中起特殊作用。

對谷子SiPHY蛋白的保守基序進行分析發現，總共鑒定了10個具有24～50個氨基酸殘基的保守基序?；騇otif 1～Motif 10 存在于SiPHY-1、SiPHY-2 和SiPHY-3 中，SiPHY-4 中沒有Motif 10。4 個SiPHY 家族成員Motif 的排布順序相同且位置相近，表明谷子SiPHY基因家族成員的保守性較高，這些保守的Motif 在谷子光形態建成中提供了重要保障。

2.4 SiPHY基因家族的啟動子順式作用元件分析

為深入了解谷子SiPHY基因家族基因成員的潛在功能，利用PlantCARE數據庫對啟動子的順式作用元件進行分析，結果如圖3 所示，共篩選鑒定出66種順式作用元件，主要與光響應、激素和逆境脅迫有關。其中，光響應元件包括AE-box、L-box、ATC-motif、GT1-motif、G-box、MRE、circadian 和ACE等，激素響應元件包括生長素響應元件（TGAelement、AuxRR-core）、赤霉素響應元件（GAREmotif、P-box、TATC-box）、脫落酸響應元件（ABRE）和水楊酸響應元件（TCA-element）等，此外，還包括干旱脅迫響應元件（MBS）、厭氧誘導元件（ARE）及參與防御和應激響應元件（TC-rich repeats）等。其中，SiPHY-1基因中含有的響應元件最多，有38種，SiPHY-2基因中含有的響應元件最少，有28 種，推測谷子中的PHYA 亞族中SiPHYA-1起主要作用。進一步分析發現，光響應元件在4 個谷子SiPHY家族基因成員中所占的比例最多，分別占26.32%（SiPHY-1）、21.43%（SiPHY-2）、21.21%（SiPHY-3）和18.92%（SiPHY-4）。這些結果表明，谷子SiPHY基因的表達主要受光信號的調節，在光形態建成中有重要作用，其次在抗逆脅迫中也發揮著作用。

2.5 不同光周期下SiPHY基因的表達模式分析

為探究SiPHY基因在谷子不同組織的表達模式，利用谷子多組學數據庫中xiaomi的11 個組織的轉錄組數據繪制SiPHY基因表達熱圖，結果如圖4 所示。除了SiPHY-2外，其余3 個SiPHY在11 個組織中均有表達。其中，SiPHY-1在萌發3 d 的種子中表達量最高，在其他10 個組織中表達量趨于一致，推測其在谷子萌發過程中發揮重要作用；SiPHY-2在11個組織中表達量均很低，在有的組織中表達量甚至為0；SiPHY-3和SiPHY-4在灌漿期的莖中表達量最高，其次在灌漿期的穗和旗葉中表達量較高，推測其在谷子灌漿期發揮重要作用。這些結果表明，光敏色素基因參與調控了谷子生長發育中的各個時期，并在種子萌發、抽穗期和灌漿期中發揮重要作用。

利用在長日照條件（LDs）和短日照條件（SDs）生長30 d 的野生型晉谷21、黃粟、大同紅谷和突變體xiaomi、xiaomi3、xiaomi4的新生葉，用qRT-PCR方法分析SiPHY基因在不同光周期下的表達量，結果如圖5 所示。從圖5可以看出，SiPHY基因在不同光周期下的6 個谷子品種中的表達模式均有差異，SiPHY-2在6 個谷子品種中均微量表達或不表達。晉谷21 中的SiPHY-1在不同光周期下的表達量有明顯差異；xiaomi、黃粟、xiaomi3中的SiPHY-4在不同光周期下的表達量有明顯差異；大同紅谷中的SiPHY-3在不同光周期下的表達量有明顯差異。這些結果表明，光周期影響谷子光敏色素的表達，不同品種的表達模式不同，光敏色素在谷子光形態建成中的作用還需進一步探究。

3 結論與討論

植物對光信號的感受是通過4 類光受體來實現的：感受紅光和遠紅光的光敏色素（Phytochrome，PHY）、感受藍光和紫外光的隱花色素（Cryptochrome，CRY）、藍光依賴的向光蛋白（Photochopin，PHOT）和UVB 受體。光敏色素是由多基因編碼，屬小基因家族，不同植物體內的家族成員和拷貝數不同。擬南芥種存在PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE等5種光敏色素[20]，而在禾本科植物水稻、玉米和小麥中只存在PHYA、PHYB 和PHYC 等3 種光敏色素，不同的是水稻中的光敏色素是單拷貝，玉米為雙拷貝，小麥為三拷貝[21]。而谷子基因組中只有4個光敏色素基因：PHYA（SiPHY-1和SiPHY-2）、PHYB（SiPHY-3）和PHYC（SiPHY-4）。研究發現，在擬南芥中光敏色素介導的光信號與脫落酸代謝途徑相互作用，光敏色素作用因子PIFs也參與了植物激素信號轉導[22]。對谷子光敏色素家族基因啟動子進行順式作用元件分析，共鑒定出66 種順式作用元件，其中，光響應元件和激素類響應元件最多，表明谷子光敏色素受光和激素的調節。

植物光敏色素廣泛存在于包括根在內的所有組織中，幾乎調節植物生命周期的每個過程。其中，PHYA負責感知遠紅光，PHYB-PHYE參與紅光介導的光形態發育[23]。PHYA對種子萌發具有促進或抑制作用，參與去黃化作用，促進開花和重置生物鐘，調控根的發育，調節特化的韌皮部細胞從暗向光形態發生過渡，參與芽休眠及花的形態發生等[24]；PHYB 能與IAA14、ARF7 以及ARF9 互作，這些互作能夠穩定IAA14 蛋白，抑制ARF7 和ARF19的轉錄活性，從而抑制黑暗誘導下胚軸不定根的形成[25]。YANG 等[26]研究發現，xiaomi早抽穗表型是由于PHYC基因第2 外顯子上G→T 突變引起的。此外，PHYD與植物避陰性反應相關，PHYE與種子萌發和避陰性反應相關[27-28]。本研究發現，SiPHY-1在萌發3 d的種子中表達量最高，推測其可能與種子萌發有關；SiPHY-2在各個時期表達量均很低，推測谷子中的2個PHYA基因中SiPHY-1起主要作用；SiPHY-3在灌漿期的莖、旗葉和穗中表達量較高，推測SiPHY-3與谷子形態建成有關。SiPHY在不同光周期條件下的表達譜顯示，SiPHY-1、SiPHY-3和SiPHY-4在長日照和短日照條件下都表達，不同材料的表達量有明顯差異。SiPHY-1在晉谷21和大同紅谷中差異顯著，SiPHY-3在大同紅谷中差異顯著，SiPHY-4在晉谷21、xiaomi、黃粟和xiaomi4中差異顯著。PHYA-2在不同材料和光周期條件下均微量表達或不表達，表明光周期參與調控光敏色素，不同材料對光敏色素的敏感性不同。光敏色素在谷子生長發育中的作用還需進一步研究。

本研究通過生物信息學的方法共鑒定出4 個SiPHYs，分布在8 號（1 個）和9 號（3 個）染色體上，均包含PHY（PF00360）、PAS（PF00989）和GAF（PF01590）結構域，與PHY 家族基因的結構域一致。不同谷子SiPHY蛋白的理化性質存在差異，但均為親水性蛋白。谷子SiPHY 與狗尾草SvPHY 親緣關系最近，與擬南芥AtPHY 親緣關系最遠。SiPHY啟動區存在光響應元件、激素響應元件和干旱響應元件等。表達譜分析結果推測，SiPHY可能與谷子的種子萌發、形態建成和抽穗開花期有關。SiPHY表達量受光周期和基因型的影響，SiPHY-2在不同光周期和不同材料中表達量均很低或不表達，推測谷子中的2 個SiPHYA只有一個發揮作用。這些結果為之后谷子中光敏色素的研究奠定了基礎，也為解析光敏色素是如何參與谷子光形態建成提出了理論依據。