草莓莖尖組培快繁體系的建立

韓如春，常 婧，趙 靜，侯雷平，李梅蘭

（1.山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801；2.小店區農業農村局鄉村振興發展中心，山西 太原 030032）

草莓（Friagaria×ananassaDuch.）為薔薇科草莓屬的多年生草本植物[1]，屬水果性蔬菜，被稱為“水果皇后”，具有較高的栽培價值[2]。其原產南美，后被世界各地廣泛引種，主要分布于亞洲、南美洲、歐洲等地[3-4]。現代醫學證明，草莓具有抗衰老作用，對白血病、腸胃病、障礙性貧血以及動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等疾病具有一定的預防和治療作用[5-8]，同時因其管理容易、適應性強等優點，在我國已經大面積栽培[9]。依據區域位置和自然條件等情況，我國草莓產地主要可以劃分為三大主產區，分別是北方產區、中部產區和南方產區[10]。其中，位于北方產區的山西省草莓種植面積和產量逐年增大，全省各地均建有草莓種植示范基地，在促進各地農業高效增收中發揮著極其重要的作用。

草莓的種苗生產主要采用匍匐莖繁殖，容易導致病毒病的發生，從而使得種苗不斷退化，出現植株低矮、果畸形、結果少等現象，嚴重影響草莓的產量和品質[11-13]。已有研究表明，通過莖尖組織培養培育脫毒草莓種苗是防治病毒病的根本對策[14-15]，該方法繁殖速度越快，脫毒效果越好，能滿足規模化生產需求[16]，使草莓品種和優良特性得以保持，可以有效提高種苗品質[17-18]。因此，為獲得優質高產的草莓，對建立其組培快繁體系的需求也越來越大，雖然有關這方面的研究尚多，但關于篩選2 個不同草莓品種的最佳快繁條件的報道相對較少，有待于進一步完善。

本試驗選取紅顏和隋珠2 個品種的匍匐莖莖尖作為外植體，通過研究莖尖誘導分化培養、繼代培養、生根培養和移栽馴化過程，確定2 個草莓品種最適宜的激素配比和培養基類型，旨在建立草莓脫毒快繁體系，為今后的生產研究提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

供試材料選用山西省主栽品種紅顏和目前市場上正在興起的新品種隋珠，取樣部位為匍匐莖莖尖。

試劑MS（M519）、Agar（A111）均購 自Phyto Technology Laboratories 公司；蔗糖（分析純）購自天津凱通化學試劑有限公司；6-BA 和NAA 均購自上海生物工程有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 外植體的獲得和消毒方法篩選 于晴天上午摘取小葉尚未展開的匍匐莖，剪下后迅速插入裝有清水的瓶中；于實驗室內，摘掉外部多余的葉片，截取2～3 cm 匍匐莖莖尖，自來水下流動沖洗2 h，用于外植體的消毒。于超凈工作臺上紫外消毒與通風各進行20 min后，將處理好的外植體用75%酒精消毒30 s，蒸餾水清洗5次[19]，再用0.1%升汞分別浸泡2、4、6、8、10、12 min，蒸餾水清洗8次。將完成消毒的外植體用已高溫滅菌的小刀、鑷子剝除小葉，切取0.5 mm 左右莖尖[20]，分別接種于初代培養基上。每處理接種3瓶，每瓶5個外植體，10 d后統計成活率和污染率，選出最佳的消毒方法。

1.2.2 初代培養基篩選 初代培養基中的6-BA設置5個質量濃度梯度：0、0.1、0.3、0.5、1.0 mg/L；NAA設置3 個質量濃度梯度：0、0.1、0.2 mg/L，自由組合后共15個處理，每個處理3瓶，每瓶接種5個莖尖，重復3 次。初代培養15 d 后統計成活率，30 d 后統計誘芽率，以選出最佳的分化培養基。

1.2.3 繼代培養基篩選 篩選到最佳初代培養基后，以2～3苗為一叢，進行轉瓶增殖。6-BA設置2個濃度梯度：0.3、0.5 mg/L，NAA 設置3 個質量濃度梯度：0、0.1、0.2 mg/L，共6 個組合，每個組合3 瓶，每瓶接種3個芽叢，重復3次。30 d后統計增殖系數，以選出最佳的增殖培養基。

增殖系數＝增殖芽數量/草莓組培苗不定芽數 （4）

1.2.4 生根培養基篩選 增殖繼代培養30 d后，選取長勢較為健壯并且長至3～4 cm的芽進行生根培養。以1/2 MS為基礎培養基，NAA設置3個質量濃度梯度，分別是0.1、0.3、0.5 mg/L，同時MS 和1/2 MS單獨設置2個處理，組合后得到5個處理，每瓶接種2 株草莓小苗，重復3 次。20 d 后統計生根率和生根狀況。

生根率＝生根數/草莓組培苗接種數×100% （5）

1.2.5 基本培養基及培養條件 MS為誘導和增殖的基本培養基，1/2 MS 為生根時的基本培養基，各個培養基均添加30 g/L 蔗糖和7.5 g/L 瓊脂。在添加完MS或1/2 MS和蔗糖之后，先將pH值調至5.8，再加瓊脂，溶解煮到清透后，分別添加植物激素生長調節劑6-BA 和NAA，最后121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌20 min，后冷卻凝固備用。培養溫度24 ℃，光照強度2 600 lx，各培養階段光照時數設定為14 h/d。

1.2.6 移栽馴化 一般通過繼代增殖后的無根苗轉接至生根培養基培養30 d左右即有10多條根系發出，此時即可進行馴化移栽。將已達到馴化移栽條件的組培苗移至溫室，在自然光條件下煉苗7 d 左右，即前2 d先采用閉蓋煉苗方式、中間松蓋煉苗2 d、最后3 d 開蓋煉苗，使組培苗逐漸適應外界環境。煉苗完成后取出組培苗，在水龍頭下流水沖洗掉多余的培養基，再用1 000倍多菌靈浸根消毒后，移栽入已消毒的滅菌基質（泥炭∶蛭石∶珍珠巖＝3∶1∶1）中，此時控制溫室內溫度23～27 ℃，空氣相對濕度40%左右[21]，每天10：00—15：00需進行適當遮陰，避免日光暴曬，當緩苗完成后進行成活率統計調查。

1.3 數據分析

采用SPSS 23.0 對試驗數據進行差異顯著性分析（α＝0.05）；采用Excel 2003軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對草莓莖尖分化的影響

結果表明（表1），升汞處理時間長短與草莓莖尖的成活率和污染率存在一定關系。消毒時間越短，污染率越高，當升汞處理時間為2 min 時，紅顏和隋珠草莓莖尖污染率最高，分別為33.33%和73.33%；隨著升汞處理時間的增加，莖尖污染率逐漸呈現降低趨勢，成活率呈現先升高后降低趨勢，且均在處理8 min 時成活率最高，說明短時間處理未能消毒完全，長時間處理使莖尖失活。此外，在最優消毒處理下，紅顏的成活率（86.70%）高于隋珠（60.00%）。

表1 不同消毒時間處理對紅顏和隋珠品種的影響Tab.1 The effect of different disinfect time on Hongyan and Suizhu

2.2 不同激素組合對草莓莖尖萌發誘導的影響

從表2 可以看出，2 個草莓品種的莖尖不添加任何激素也可誘導出芽苗，但成活率和誘芽率偏低；僅添加NAA 時，隨著質量濃度的增加，誘導出的愈傷組織越來越多，而且誘芽率也不高；僅添加6-BA 時，長勢優于僅添加NAA，誘芽率也較高，但是隨著其質量濃度的增加，植株褐化加重，誘芽率也會降低。

表2 不同激素組合對紅顏和隋珠莖尖萌發誘導的影響Tab.2 Effects of different hormone combinations on shoot tip germination and induction of Hongyan and Suizhu

比較2個種激素的組合，對于紅顏品種來說，以處理10即MS＋6-BA 0.3 mg/L＋NAA 0.1 mg/L的培養基中成活率最高，誘導出芽苗多，長勢也較好；而對于隋珠品種，誘導成苗效果最好的培養基激素組合是處理12，即MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，成活率達93.33%，誘芽率達68.23%，且長勢旺盛，葉色翠綠。2個品種的NAA質量濃度均為0.1 mg/L，但是隋珠品種要求的6-BA質量濃度略高于紅顏品種。總而言之，激素質量濃度過低或過高都不利于莖尖的萌發，適宜的激素配比才可促進紅顏和隋珠外植體的正常萌發發育。

2.3 不同激素組合對草莓不定芽增殖的影響

經過初代培養基的誘導培養，篩選到激素質量濃度為6-BA 0.3～0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L時，2個草莓品種的莖尖成活率較高，所以，繼代培養基以上述激素配比為組合繼續篩選。由表3可知，紅顏由單獨苗增殖至芽叢時間需要20～40 d，而隋珠則需30～50 d。

表3 不同激素組合對隋珠和紅顏不定芽增殖的影響Tab.3 Effect of different hormone combination on adventitious bud proliferation in Hongyan and Suizhu

比較各個激素的配方，紅顏草莓最適宜的增殖培養基是5號培養基，即MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，增殖系數達到5.20；且相同NAA質量濃度下，6-BA 0.5 mg/L 處理的增殖系數高于0.3 mg/L。針對隋珠品種，其最佳增殖培養基為MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，增殖系數為4.21；且6-BA 0.5 mg/L 處理的增殖系數均高于0.3 mg/L 處理，誘導叢芽時間也縮短，從40～50 d 縮短為30～40 d。綜合來看，紅顏草莓莖尖分化能力優于隋珠，增殖效果良好，誘導出叢芽的時間也較短，6-BA質量濃度一定時，高質量濃度的NAA 更有利于腋芽的增殖，增殖系數也隨之提高，但6-BA質量濃度不宜太高，過高會影響草莓腋芽分化增殖。

2.4 不同激素組合對2種草莓生根培養的影響

將分成單株且長至3～4 cm的草莓小芽進行生根培養。由表4可知，采用以1/2 MS為基本培養基的2個草莓品種的生根率顯著高于以MS為基本培養基的處理1，說明1/2 MS 比MS 更有利于組培苗生根。對于紅顏品種，當基本培養基為1/2 MS、不添加NAA 時，生根率高達100%，平均根數達18 條左右，且生根效果最好；隨著NAA 濃度的不斷升高，根基部出現的愈傷組織逐漸增多，生根率有所下降，且影響根系生長。而對于隋珠品種，當NAA質量濃度為0.1 mg/L 時，生根率最高為100%，生根條數最多，平均根長也達到最長；當NAA質量濃度上升為0.3、0.5 mg/L 時，生根率也達到100%，但是根長縮短，愈傷增多，苗黃化，葉卷曲。

表4 不同激素組合對紅顏和隋珠品種生根的影響Tab.4 The effect of different combinations on rooting of Hongyan and Suizhu

綜合來看，1/2 MS顯著優于MS培養基，1/2 MS和NAA 都能提高生根率和生根數，其中隋珠品種生根率高，但生根數少，根條短小，與紅顏品種有所差別。

2.5 移栽馴化

2 個草莓品種的組培苗生根培養30 d 左右，葉片舒展呈深綠色且出現表皮毛后，即已達到移栽馴化的條件。自然光照條件下閉蓋、半松蓋、開蓋馴化7 d 后，將其基部培養基洗去，后用1 000 倍多菌靈浸根消毒，然后栽入泥炭∶蛭石∶珍珠巖配比為3∶1∶1的混合基質中，使其健康生長，紅顏和隋珠品種的移栽成活率均高達100%（圖1）。

3 結論與討論

在草莓組培快繁試驗中，消毒劑所帶來的消毒效果對草莓組織培養是否成功有著很大影響。相同濃度的升汞處理時間不同，對莖尖的消毒效果也明顯不同，當不處理或者處理時間過短時，外植體的污染率最大接近100%；但是當升汞處理時間逐漸增加，其成活率逐漸降低，這可能是由升汞對外植體本身活力造成了不可逆轉的傷害而引起的。由此可見，當選用0.1%升汞處理莖尖時，適宜的處理時間是關鍵。本試驗結果表明，乙醇加上0.1%升汞處理8 min 是草莓莖尖消毒的最佳方式，與郭靖[22]的研究結果一致。

植物激素和植物生長調節劑的種類、含量對外植體莖尖萌發影響很大，配比適中可促進莖尖細胞分化能力和細胞的形態建成。6-BA屬于細胞分裂素類，可以很好地促進細胞分裂，誘導植株形成新芽并誘導愈傷組織的產生；而NAA 能促進細胞的分裂與擴大，誘導形成不定根。曹善東[23]經研究篩選出2 種組培快繁脫毒草莓苗的培養基配方為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L 和MS＋6-BA 1.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L，發現6-BA 質量濃度大于1.0 mg/L時，莖尖成活率下降，高質量濃度抑制不定芽形成；6-BA質量濃度一定時，高質量濃度的NAA更有利于腋芽的增殖，增殖系數也隨之提高。本研究中，僅添加6-BA 情況下，莖尖也可以萌發，但誘芽率低，當6-BA質量濃度為0.3 mg/L時，紅顏品種的誘芽率較高，而隋珠品種則是在6-BA 質量濃度為0.5 mg/L 時誘芽率最高；僅添加生長素時誘芽率也較低，說明在芽的分化過程中，不單單取決于單一激素的質量濃度，而且取決于激素之間的比例，不同品種對植物生長調節劑的需求稍有差異。在芽的增殖過程中，隨著外源激素質量濃度的不斷升高，2 個草莓品種的誘導分化和增殖能力也明顯提高，但是當達到一定的激素配比時，草莓組培苗發黃發褐，長勢不好，這與張玲等[24]的研究結果類似，在他們的試驗中，章姬草莓最佳的增殖培養基是MS＋6-BA 0.5 mg/L＋IBA 0.10 mg/L。本研究比較2個品種，隋珠的增殖效果相比紅顏較差，同時誘導出叢生芽的時間也較長，說明基因型會影響芽體的增殖。顏昌敬[25]研究發現，草莓試管苗比較容易生根，在無植物生長調節劑的培養基上就能長出大量根系，添加NAA 0.1 mg/L后發根量反而減少。張建盈等[26]研究發現，不添加IBA 的1/2 MS是白雪公主草莓最適宜的生根培養基，生根率達100%，平均生根數為10條，平均根長為5.00 cm。本研究中，隋珠品種的生根率在有激素時較高，而紅顏品種沒有激素時生根率就可以達到100%，而且平均生根數是隋珠的3倍左右，表明不同草莓品種生根所需要的植物生長調節劑類型有所不同，同時適宜的激素配比有利于組培苗的生根。

2 個草莓品種的莖尖誘導成活率、腋芽增殖分化能力和生根能力都有所區別，這可能是由于不同的品種會對不同培養基的激素配比存在不同的敏感程度，外部條件如生長環境和植株本身種性等原因都會造成它們的莖尖萌發能力、腋芽增殖能力及生根率等都有所不同。在本試驗草莓組培的過程中，出現了褐化和玻璃化等問題，仍需要進行更深一步的相關研究。

本研究結果表明，草莓紅顏和隋珠品種0.1%HgCI2滅菌的最佳時間均為8 min，成活率分別達86.70%和60.00%。最適宜的莖尖誘導培養基紅顏品種是MS＋6-BA 0.3 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，而隋珠品種為MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，誘芽率分別為68.00%和68.23%。最適宜的繼代增殖培養基紅顏品種是MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，隋珠品種為MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，增殖系數分別達5.20 和4.21。紅顏品種最適宜的生根培養基是1/2 MS，而隋珠品種需在1/2 MS基本培養基基礎上加入NAA 0.1 mg/L，生根率均達到100%。無菌苗移栽于泥炭∶蛭石∶珍珠巖為3∶1∶1的混合基質中，均可成活，且長勢良好。