硬粒小麥與粗山羊草人工合成六倍體冬小麥新種質(zhì)研究

左靜靜，閆貴云，王 敏，左 敏

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太原 030031）

小麥（Triticum aestivumL，AABBDD，2n＝6x＝42）是世界上主要的糧食作物之一，播種面積和產(chǎn)量均居世界第一，且是世界35%人口的主要糧食[1]。在小麥進化過程中，只有極少數(shù)栽培二粒小麥與粗山羊草通過天然雜交形成了六倍體小麥，大大降低了六倍體小麥的遺傳多樣性，產(chǎn)生了小麥的“進化瓶頸”[2-4]。20世紀(jì)70年代以來，半矮稈高產(chǎn)小麥品種的育成和大面積推廣，替代了變異類型豐富的、適應(yīng)性好的小麥地方品種。這種長期人為的定向選擇育種，加速了小麥群體遺傳多樣性的散失和各種病害的加重，而長期的小麥品種間的雜交育種，使其遺傳基礎(chǔ)愈來愈窄，遺傳變異愈來愈小[5-7]。為了豐富小麥遺傳基礎(chǔ)，迫切需要從小麥原始種和小麥野生近緣種中向栽培小麥導(dǎo)入優(yōu)異基因。目前，提高小麥遺傳多樣性已成為小麥遺傳育種的一個重要任務(wù)[8]。山羊草屬（Aegilops）是和小麥屬（Triticum）親緣關(guān)系最近的一個屬，而粗山羊草（Aegilops tauschii（Coss.）Schmal DD，2n＝14）是和小麥最近的種之一，粗山羊草與普通小麥的D染色體組完全同源，可發(fā)生遺傳物質(zhì)的自由重組和交換，二者雜交無負遺傳效應(yīng)。粗山羊草含有豐富的抗病、抗蟲、優(yōu)質(zhì)亞基、耐旱、耐寒及耐鹽等優(yōu)異基因，其遺傳多樣性遠比小麥的D染色體組豐富[9]。硬粒小麥（Triticum durum）又稱通心粉小麥，染色體組型為AABB，含有銹病、白粉病、黑穗病、黃矮病（BYDV）、紋枯病、麥蠅等多種病蟲害的抗源[10]。因此，硬粒小麥和粗山羊草都是用來改良普通小麥非常好的選擇。

粗山羊草和硬粒小麥合成雙二倍體，在國外主要是由國際玉米小麥改良中心（CIMMYT）研究并合成，各科研院所和大學(xué)所使用的都是來自CIMMYT的雙二倍體。目前，國內(nèi)外研究者的更多注意力在粗山羊草的基因組研究、優(yōu)質(zhì)亞基的克隆及抗病性鑒定和基因推導(dǎo)，還有細胞遺傳學(xué)及育性研究。基因組研究、優(yōu)質(zhì)亞基的克隆、抗病性鑒定和基因推導(dǎo)、細胞遺傳學(xué)及育性研究將是未來一定時期的主要研究動向[11]。在育種方面的研究已開始起步，如四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院20世紀(jì)末從CIMMYT引進硬粒小麥-粗山羊草雙二倍體，育成了川麥42[12]。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)也利用董玉琛院士等合成的雙二倍體開始了初步育種研究[13]。

現(xiàn)有技術(shù)手段一方面還沒有適合在我國北方冬麥區(qū)和黃淮海冬麥區(qū)使用的合成麥和合成方法，來自CIMMYT的合成小麥大多是春性的，不適宜我國冬麥區(qū)育種使用，且合成過程中合成麥的成胚率成苗率不高[14]。另一方面，有團隊的合成麥?zhǔn)抢脦ё匀患颖痘虻挠擦Ｐ←湥↙angdon）和粗山羊草合成，母本的選擇局限于Langdon一種，遺傳信息存在局限性[15]。

本研究為解決現(xiàn)有合成小麥均為春性小麥，在冬麥區(qū)不適用，遺傳信息受局限且成胚成苗率低的問題，通過硬粒小麥與粗山羊草人工合成冬性六倍體小麥，旨在建立一種高遺傳多樣性且高成胚成苗率冬麥區(qū)小麥的合成方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

配置雜交組合的母本為四倍體硬粒小麥170、153、172、176、159、175、145、149、141、155、149、182、178、184、157、159、硬1、硬3、硬6、硬8、硬9、硬12，父本粗山羊草分別為Y57、Y168、Y126、Y205、Y207、Ae35、Ae46、C7、MO3035、MO5035、RM0183。材料由中國國家種質(zhì)庫提供，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心保存。其中，四倍體硬粒小麥為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥新材料課題組收集的春性硬粒小麥且無法自然加倍，經(jīng)多年田間鑒定篩選出的越冬性相對較好、抗逆性、品質(zhì)優(yōu)良的材料；粗山羊草均為冬性，經(jīng)鑒定抗逆性較好的材料。

培養(yǎng)基Ⅰ：pH 值為5.8～6.4，蔗糖40 g/L，AgNO310 mg/L，H2SO38 mg/L，KH2PO43 g/L，2，4-D 100 mg/L。

培養(yǎng)基Ⅱ：1/2 MS培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基Ⅲ：在1/2 MS 培養(yǎng)基中加入2 mg/L 的2，4-D。

培養(yǎng)基Ⅳ：在1/2 MS 培養(yǎng)基中加入3 mg/L 的6-BA和0.1 mg/L的NAA。

1.2 試驗方法

試驗中的實驗室部分在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥新材料實驗室完成，大田部分設(shè)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽試驗基地，所在生態(tài)區(qū)為國家北部冬麥區(qū)。

1.2.1 播種 選取硬粒小麥和粗山羊草進行田間播種，其中，硬粒小麥和粗山羊草的播量比為2∶1，硬粒小麥分3期播種，每期間隔3～5 d，粗山羊草在硬粒小麥播種第1期的時候播種。

1.2.2 雜交授粉 根據(jù)確定的雜交組合，在母本群體內(nèi)選擇典型、健壯植株的主莖穗（剛抽出葉鞘、花藥呈綠色）進行去雄、套袋，去雄后48～72 h，用新采集的粗山羊草的花粉授粉并套袋。

1.2.3 幼胚拯救 授粉24 h后，將硬粒小麥植株穗下30～40 cm剪下，并用自來水沖洗剪斷處30 s后，插入液體培養(yǎng)基Ⅰ中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度21～25 ℃，培養(yǎng)濕度80%，光照強度1 500～2 500 lx，光照時間8 h/d，培養(yǎng)14 d后，將小麥籽粒從麥穗中剝離出來進行滅菌；在超凈臺上剝離滅菌后籽粒的幼胚并接種于培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度21～25 ℃，光照強度1 500～2 500 lx，光照時間12 h/d；發(fā)育不良的幼胚接種于培養(yǎng)基Ⅲ中，待幼胚發(fā)育正常后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基Ⅱ中，如在培養(yǎng)基Ⅲ內(nèi)繼續(xù)不良發(fā)育的幼胚轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基Ⅳ中，在培養(yǎng)基Ⅳ中的幼胚發(fā)育正常后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基Ⅱ。

1.2.4 春化培養(yǎng) 待幼胚長至10～15 cm 時，將幼苗置于人工培養(yǎng)箱進行春化培養(yǎng)30～35 d，培養(yǎng)條件為：晝夜溫度10～15 ℃/0～4 ℃，日間光照12 h，光照強度1 000～2 000 lx。

1.2.5 染色體加倍 當(dāng)日平均氣溫低于10 ℃時，將經(jīng)過春化的幼苗移栽于大田，選取靠墻的陽畦搭建塑膜拱棚；當(dāng)日平均氣溫超過10 ℃時，揭去塑膜；當(dāng)幼苗長出2～3個分蘗時，在幼苗植株一側(cè)挖一個直徑為10～15 cm 的小坑，露出1/2 的根系，露出的根系在清除泥土后放入一個直徑10 cm的小燒杯中，然后用吸管注入體積分數(shù)為0.1%的秋水仙素溶液直至沒過根系，在坑口蓋一塊塑料膜，用土覆蓋，8 h后，去掉燒杯和剩余的秋水仙素溶液，將根系至分蘗節(jié)輕輕重埋土中；14 d后，重復(fù)上述步驟處理另一側(cè)的根系，隨后繼續(xù)進行田間培養(yǎng)管理直至收獲，期間定點觀察并統(tǒng)計越冬前后的死亡株數(shù)。

1.2.6 染色體數(shù)目鑒定 采用醋酸洋紅染色法觀察合成小麥染色體F1數(shù)目[16]。合成麥種子用75%的酒精消毒30 s，22 ℃左右用水浸泡24 h 至種子露白，置于鋪有濕潤吸水紙的培養(yǎng)皿中，腹溝向下，（22±2）℃培養(yǎng)12 h，1～4 ℃培養(yǎng)12 h，交替培養(yǎng)，待根長至1.5～2.0 cm時，剪下根尖，置于0～4 ℃的冰水混合物中預(yù)處理24 h，用卡諾固定液固定24 h，1 mol/L的HCl恒溫（60 ℃）水解8 min，無菌水沖洗3～4次，洋紅染液中染色24 h，再用45%冰醋酸壓片，用OLYMPUS IX51-A12PH觀察記錄染色體數(shù)目。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2017 和SPSS 19.0 進行統(tǒng)計分析。

對33 個組合的成胚率、成苗率、平均成活率、平均加倍率和死株率進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成麥成胚率分析

以硬粒小麥與粗山羊草雜交，授粉后13 d統(tǒng)計雜交穗的結(jié)實率。由表1 可知，33 個雜交組合以157/C7的成胚率最高，為100%，176/Y168的成胚率最低，為34.29%。33 個雜交組合的平均成胚率為69.07%。成胚率在80%～100%的組合有6個，分別為182/C7、145/Ae35、178/MO3035、145/Y168、141/C7、157/C7，成胚率在70%～80%的組合有10個，成胚率在60%～70%的組合有10個，成胚率在50%～60%的組合有6 個，成胚率在50%以下的只有1 個組合，即176/Y168。

表1 雜交組合成胚成苗加倍及越冬性情況Tab.1 Frequencies of embryos，percentages of plantlets，rate of chromosome doubling by crossing durum wheat with Aegilops tauschii

續(xù)表1 雜交組合成胚成苗加倍及越冬性情況Tab.1 （Continued）Frequencies of embryos，percentages of plantlets，rate of chromosome doubling by crossing durum wheat with Aegilops tauschii

2.2 合成麥成苗率分析

由表1 可知，33 個雜交組合中，以157/C7 的成苗率最高，為85.71%，176/Y168 的成苗率最低，為28.57%，33 個雜交組合的平均成苗率為55.08%。合成麥成苗率較高的5個組合分別為：157/C7、182/C7、141/C7、145/Y168、182/Y168。合成麥成苗率低于40%的組合有5個，分別為：176/Y168、175/Ae35、159/Y168、159/Ae46、153/Ae35。

2.3 加倍率分析

從表1可以看出，33個雜交組合的加倍率均處于較高的水平，其中，染色體加倍處理植株后有7個組合的加倍率均為100%，即176/Ae35、175/Y168、182/Y205、159/Y207、157/C7、硬9/RM0183、硬8/RM0183，33個雜交組合平均加倍率為85.40%，超過平均加倍率的組合有19個。加倍率最低的組合為141/C7，其加倍率為53.33%。

2.4 合成麥越冬性分析

從表1 可以看出，33 個雜交組合中，153/Ae35的死株率最低，為1.90%，141/C7 的死株率最高，為54.80%。33個雜交組合中27.27%的雜交組合死株率低于5%，共有9個，分別為：153/Ae35、172/Y168、176/Ae35、175/Y168、155/Y205、182/Y205、184/C7、157/C7、硬9/RM0183，這些組合可以在試驗所在的生態(tài)區(qū)正常越冬。死株率高于5%的組合占比72.73%，共24個，這些組合在試驗所在的生態(tài)區(qū)越冬性差，不適宜在北部冬麥區(qū)種植。由此可見，人工雙二倍體在北部冬麥區(qū)表現(xiàn)出較弱的越冬性。

2.5 合成麥大田長勢及籽粒情況

本試驗對加倍的33個合成麥的F1種子根尖細胞染色體數(shù)目進行了鑒定，均為2n＝42（圖1）。在33 個合成組合中有9 個順利越冬，其大田長勢良好，并且表現(xiàn)出了很強的分蘗性和較高的結(jié)實率。157/C7 合成麥的植株表現(xiàn)出良好的分蘗性和大田長勢，其籽粒表現(xiàn)出良好的成穗和結(jié)實力，然而籽粒的顏色一致性較差，飽滿度欠佳（圖2）。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，從33個合成材料中，獲得了9 個可以正常越冬的組合，證明利用硬粒小麥與粗山羊草創(chuàng)制人工合成六倍體冬性小麥?zhǔn)强尚械摹榱颂岣邌伪扼w幼胚的成胚率、成苗率，本研究根據(jù)單倍體胚的狀態(tài)，接種于不同的培養(yǎng)基上，并根據(jù)萌動和發(fā)育狀態(tài)適時調(diào)整培養(yǎng)基。正常發(fā)育的胚接種于1/2 MS培養(yǎng)基Ⅱ上，發(fā)育不良的幼胚接種于添加2 mg/L 2，4-D的1/2 MS培養(yǎng)基Ⅲ中，待幼胚發(fā)育正常后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基Ⅱ中，如在培養(yǎng)基Ⅲ內(nèi)繼續(xù)不良發(fā)育的幼胚轉(zhuǎn)入添加了3 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基Ⅳ中，在培養(yǎng)基Ⅳ中的幼胚發(fā)育正常后轉(zhuǎn)入1/2 MS 培養(yǎng)基Ⅱ中。為了提高幼苗的加倍率，采用體積分數(shù)為0.1%的秋水仙素溶液浸泡處理幼苗的1/2 根系8 h，14 d 后，同樣的方法處理另外1/2根系。

目前，由粗山羊草和硬粒小麥合成的小麥存在以下問題：（1）不適宜我國冬麥區(qū)育種使用，我國使用的大都來自CIMMYT，而這些合成麥大都是春性的，不適合我國北方冬麥和黃淮海冬麥區(qū)使用[17-19]；（2）母本的選擇受局限，進而存在遺傳信息的局限性，目前在我國還有一部分合成麥來自帶自然加倍基因的硬粒小麥Langdon 和粗山羊草合成[20]，母本只能選擇Langdon，遺傳信息非常狹窄[21-24]；（3）據(jù)統(tǒng)計目前合成方法的成胚率在10%左右，成苗率在4%左右[25]。本研究為解決現(xiàn)有合成小麥存在冬麥區(qū)不適用、遺傳信息受局限且成胚成苗率低的問題，提供了一種高遺傳多樣性且高成胚成苗率冬麥區(qū)小麥的合成方法[26]。

本研究選用的硬粒小麥作母本，由于母本不受限，擴大了母本遺傳信息選擇的范圍，通過遠緣雜交、幼胚培養(yǎng)和染色體加倍人工合成六倍體小麥，將硬粒小麥和粗山羊草中蘊藏的大量有用和被長期定向選擇丟失的基因有效導(dǎo)入普通小麥，拓寬了小麥的遺傳基礎(chǔ)，與此同時，人工春化的過程使種子能順利進入幼苗期進而適應(yīng)北方冬麥區(qū)的溫度環(huán)境，克服了溫度對其生長的不利影響，此外，培養(yǎng)基Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的配合使用保障幼胚正常發(fā)育，進一步提高種子的成胚率、成苗率，有效解決了現(xiàn)有合成小麥存在冬麥區(qū)不適用、遺傳信息受局限且成胚成苗率低的問題。