微波處理-氣相色譜法測定洋蔥中5種氯代酰胺類除草劑殘留

方海仙，耿慧春，普婭麗，王莉麗，李昕昀，劉宏程

（1.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明 650205；2.農業農村部農產品質量監督檢驗測試中心（昆明），云南 昆明 650205；3.元江縣農產品質量安全檢測站，云南 元江 653300；4.云南經濟管理學院，云南 昆明 650106）

洋蔥[1-3]是百合科蔥屬2年生草本植物的鱗莖，是人們生活中必不可少的蔬菜，具有降血壓、預防血栓形成、防癌抗癌、降低血糖、殺菌消炎、補充人體微量元素、預防感冒、治療口腔潰瘍等多種功效。同時，洋蔥也是一類較為特殊的蔬菜，其中含有大量的烷基硫代半胱氨酸、亞砜類化合物等及其活性酶，在粉碎樣品制成漿狀后會產生大量含硫化合物[4-5]，在農藥殘留檢測中會產生干擾，在日常檢測中屬于較難分析的樣品。

洋蔥在生長過程中，由于田間雜草影響其產量和品質，因此，會使用除草劑除草。除草劑能使雜草徹底或者選擇發生枯死，被廣泛地應用于各種草害的防治，但是，它在農業生長中長期大量使用，不可避免地造成了越來越多的殘留。目前已研究報道較多的除草劑主要有酰胺類、三嗪類、磺酰脲類、二硝基苯胺類、苯脲類、二苯醚類、苯氧羧酸類和咪唑啉酮類[6]，其中，酰胺類除草劑是一類高效、高選擇性的芽前除草劑，分為氯代酰胺類和酰芳胺類，主要用于防除1年生禾本科雜草與部分闊葉雜草，被應用于防治洋蔥生長過程中的草害。氯代酰胺類除草劑能提高作物產量，同時也對環境和人體造成了嚴重危害，研究表明[7]，它們的代謝物能夠引起人類淋巴細胞的姐妹染色單體的交換，乙草胺和丁草胺具有弱的基因毒性，乙草胺已被美國環保局定位B-2 類致癌物，因此，該類除草劑殘留檢測在限量范圍內才能保證食用安全性。

蔥蒜類蔬菜富含蒜氨酸類物質（即烷基硫代半胱氨酸和它的亞砜類化合物），該物質是最初且最重要的含硫化合物，是天然存在的內源性非蛋白氨基酸，不同的植物中蒜氨酸類物質的成分和含量不同，洋蔥中主要是蒜氨酸、甲基蒜氨酸和丙基蒜氨酸。蒜氨酸酶又稱蒜酶，它是一種糖蛋白，有二聚體、三聚體、四聚體等形式，不同的植物蛋白聚合形式是不同的，洋蔥為四聚體[8]。在完整的細胞內，蒜氨酸酶和底物位于細胞的不同結構部位，蒜氨酸類物質以穩定、無臭的形式存在于細胞質中，能分解蒜氨酸類物質的蒜酶位于液泡中，液泡周圍充滿了細胞質，由于膜作為屏障，所以，二者無法接觸。當細胞遭到破壞，如擠壓、粉碎等作用時，蒜氨酸酶與底物相互接觸發生反應生成丙酮酸、氨和包括蒜素在內的含硫化合物。在日常的殘留檢測中，蒜氨酸類物質本身不會干擾檢測，但樣品被粉碎時，其內含的活性酶與底物接觸后產生大量的含硫化合物，該類物質與農藥性質相近，易與農藥一起提取出來，且含量遠遠高于農藥殘留的含量，在色譜和質譜測定中造成很強的背景干擾。目前，日常采用的一些國家標準和行業標準前處理方法，無法將這類物質去除。因此，建立一種能夠有效消除硫化物干擾、準確性好的氯代酰胺類除草劑殘留檢測方法對洋蔥質量控制具有重要的研究意義。

微波[9-10]是指波長在1～1 000 mm的電磁波，具有穿透、反射和吸收特性，用微波加熱時食物會吸收微波而使自身發熱。微波處理通過加熱鈍化酶的活性而作為一種鈍酶技術[11-12]，其作用機理主要是基于微波的熱效應和非熱效應。熱效應是指微波作用于物料，使物料表里同時吸收微波能，溫度升高后使酶分子發生不可逆變性，導致失活，達到鈍化酶的目的。非熱效應[13-15]是指在微波電磁場的作用下物料中酶的空間結構被干擾和破壞，致使酶的分子結構中氫鍵松弛、斷裂，使酶的親和力降低，最終導致酶活力下降。如傅偉昌等[16]采用單因素試驗及正交試驗研究微波處理對松花粉脂肪酶滅活率，結果表明，當松花粉水分質量分數14%、微波功率324.3 W、微波時間2 min 時，脂肪酶滅活率為92.4%。因此，微波處理通過控制溫度可用于鈍化酶的活性，將含硫蔬菜硫化物截留在樣品前處理階段。

本研究根據含硫化合物產生的特點，采用微波處理鈍化蒜酶的活性，避免含硫化合物的產生，在殘留檢測時能有效解決背景干擾問題，通過優化量化微波處理條件，得到最優的前處理條件，建立酰胺類除草劑殘留分析檢測方法，為洋蔥的安全性監控和評價提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

GC-7890B 氣相色譜（配有7683 自動進樣器、63Ni電子捕獲檢測器μECD，美國安捷倫公司）；TDL-40B 低速大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）；HY-5A 振蕩器（金壇市科析儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（德國海道爾夫公司）；電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；水浴氮吹儀（美國Organomation N-EVAP 公司）；渦旋振蕩器（美國Thermo Scientific 公司）；LG 微波爐（樂金電子（天津）電器有限公司，工作頻率為2.45 GHz 的瓷控管微波爐）。

甲草胺GBW（E）081400、乙草胺GBW（E）061615、丙草胺GBW（E）081564、異丙甲草胺GBW（E）081402、丁草胺GBW（E）061412，以上標準品質量濃度均為1 000 μg/mL，購自農業農村部環境質量監督檢驗測試中心（天津）。

弗羅里矽（Florisil）固相萃取柱（1 g，6 mL，美國Supelco 公司）。正己烷（色譜純，美國J.T.Baker 公司）；丙酮（色譜純，美國J.T.Baker公司）；乙腈（分析純）；氯化鈉（分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準儲備溶液的配制 分別移取乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺、丙草胺1.0 mL用正己烷定容至25.0 mL，配制成單一標準儲備液，貯存在-20 ℃冰箱中。準確吸取一定體積各單一標準儲備液，用正己烷定容至25.0 mL，得到5 種氯代酰胺類的混合標準溶液，貯存在-4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 樣品微波處理

1.2.2.1 洋蔥大小確定 洋蔥一層層剝開，分別切成大小約為4、2、1 cm2的片，準確稱取35.0 g試樣至250 mL 三角瓶中，加入70.0 mL 乙腈，在勻漿機中以16 000 r/min勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有7～10 g 氯化鈉的100 mL 具塞量筒中，收集濾液50～60 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。

1.2.2.2 微波功率密度確定 洋蔥一層層剝開，切成大小約1 cm2的片，準確稱取35.0 g試樣至250 mL三角瓶中，三角瓶口用鋁箔紙封好待用。將上述裝好樣品的三角瓶置于微波工作站的加熱腔內轉盤中央，固定微波時間為20 s，分別在微波功率密度為0、2、6、10、14、20 W/g處理后，取出后待冷卻至室溫，再加入70.0 mL 乙腈，在勻漿機中16 000 r/min勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有7～10 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液50～60 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。

1.2.2.3 微波時間密度確定 洋蔥一層層剝開，切成大小約1 cm2的片，準確稱取35.0 g 試樣至250 mL 三角瓶中，三角瓶口用鋁箔紙封好待用。將上述裝好樣品的三角瓶置于微波工作站的加熱腔內轉盤中央，固定微波功率為14 W/g，微波時間密度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 s/g 處理后，取出后待冷卻至室溫，再加入70.0 mL乙腈，在勻漿機中16 000 r/min勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有7～10 g 氯化鈉的100 mL 具塞量筒中，收集濾液50～60 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。

1.2.3 樣品的凈化 從具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈溶液，放入150 mL濃縮瓶中，將濃縮瓶用旋轉蒸發儀濃縮至近干，加入2.0 mL正己烷，蓋上鋁箔，待凈化。

將弗羅里矽柱依次用5.0 mL 丙酮＋正己烷（10∶90（V/V））、5.0 mL 正己烷預淋洗，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即倒入上述待凈化溶液，用150 mL 濃縮瓶接收洗脫液，用5 mL 丙酮＋正己烷（10∶90（V/V））沖洗燒杯后淋洗弗羅里矽柱，并重復一次。將盛有淋洗液的濃縮瓶在旋轉蒸發儀上（水浴溫度＜40 ℃）濃縮至近干，用正己烷定容至5.0 mL，在漩渦混合器上混勻，分別移入2 個2 mL自動進樣器樣品中，供色譜測定。

1.2.4 氣相色譜條件優化 色譜柱為DB-17 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氮氣（99.999%），恒流模式，柱流速為1.0 mL/min；進樣量為1.00 μL，不分流進樣，進樣口溫度為200 ℃；尾吹氣流量為60.0 mL/min；微電子捕獲檢測器（μECD）溫度為320 ℃；柱溫升溫程序：初始溫度150 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至270 ℃，保持15 min。

1.2.5 工作曲線繪制 分別移取適量的5 種氯代酰胺類混合標準儲備液，用正己烷稀釋得到一系列工作使用溶液。按照1.2.4 的條件進行分析，采用外標法定量，以標準溶液的峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標繪制工作曲線。

1.2.6 添加回收試驗 分別稱取不含5 種氯代酰胺類除草劑殘留的洋蔥樣品10 份，每份35.0 g，其中1 份為對照，另外9 份樣品分為3 組，每組3 份。第1組每份均加入混合標準溶液0.10 mL，使樣品質量分數為0.01 mg/kg；第2 組添加混合標準溶液0.5 mL，樣品質量分數為0.05 mg/kg；第3 組添加混合標準溶液2.5 mL 使樣品質量分數為0.25 mg/kg，分別將上述樣品充分混勻，放置1 h 后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4 進行樣品前處理和分析測定，每個添加濃度重復測定3 次，計算平均回收率和相對標準偏差。

1.2.7 實際樣品測定 在開始對樣品進行GCECD 測試之前，先測定標準工作液，直至相應組分色譜響應值穩定后開始進標樣，制作校正曲線，之后進行樣品測定。

隨機測試送檢的10批次樣品，分別按照1.2.2、1.2.3和1.2.4進行前處理和分析測定。

1.3 基質效應

基質指的是樣品中除分析物以外的組分，常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結果的準確性，這些影響和干擾被稱為基質效應。基質效應按照以下公式[17]進行計算。

當ME為正值時，為基質增強效應，當ME為負值時，為基質減弱效應。基質效應在-20%～20%為弱基質效應，在-50%～-20%和20%～50%為中等基質效應，超過-50%或50%為強基質效應。

2 結果與分析

2.1 微波處理時樣品狀態的選擇

試驗過程中發現樣品的狀態對微波處理效果有較大影響。試驗表明，樣品不滅活處理，背景干擾相當強，無法進行殘留測定；粉碎后的樣品經微波滅活后，消除基質干擾的作用不明顯，對殘留測定仍有較大影響。因此，本試驗將洋蔥一層層剝開后切成大小約為4、2、1 cm2的片，經1.2.2.1 和1.2.3處理后，采用1.2.4氣相色譜條件上機測定，結果如圖1所示。

從圖1 可以看出，當洋蔥大小為4 cm2時，雜質干擾最少，但存在勻漿時較難將其勻漿細的問題，當洋蔥大小為2、1 cm2時，干擾相對較大，但沒有明顯差別，體積小時勻漿時容易將其勻漿細。綜合考慮，洋蔥大小確定為1 cm2。

2.2 微波功率密度的確定

從圖2 可以看出，當微波功率密度≤10 W/g時，與未微波處理比較，雜質干擾更大，可能原因是這個微波功率密度下，酶的活力更強，加速了酶促反應；當微波功率密度≥14 W/g 時，微波處理對雜質干擾具有明顯的效果，微波功率密度太大，樣品易于失水而烤糊，基于此，本試驗選用微波功率密度為14 W/g。

2.3 微波時間密度的確定

由圖3 可知，當微波時間密度≤0.5 s/g 時，跟未微波處理比較，雜質去除效果不明顯，當微波時間密度≥0.7 s/g 時，微波處理對雜質干擾具有明顯的效果，微波時間密度大，樣品易于失水而不易提取，基于此，本試驗選用微波時間密度為0.7 s/g。

2.4 微波處理后的色譜分析

在1.2.4條件下，洋蔥不同處理的色譜及5種氯代酰胺類除草劑色譜分析如圖4、5所示。

從圖4—5 可以看出，未經微波處理洋蔥雜峰很多，峰很高，幾乎無法測定低濃度農藥殘留；而微波處理后的洋蔥，雜峰明顯減少，峰很小，有效地消除了其基質中硫化物對待測物的干擾，表明微波處理可有效減少硫化物的干擾。

2.5 色譜條件的優化

為了得到5 種氯代酰胺類除草劑的最佳峰型和分離效果，本試驗從不同程序升溫、進樣口溫度、流量、檢測器溫度、不同色譜柱等方面對儀器的檢測條件進行優化，比較了5 種農藥在DB-1 和DB-17這2根不同極性色譜柱上的響應，其色譜結果如圖6所示。

從圖6可以看出，相同濃度的氯代酰胺類除草劑在色譜柱DB-17 上的響應比較大，靈敏度高，而在色譜柱DB-1 上的響應較差，因此，本試驗選用DB-17色譜柱。

2.6 方法學驗證

2.6.1 標準曲線、檢出限、定量限 配制質量濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL的5種氯代酰胺類除草劑混合標準溶液，以峰面積（Y）對其質量濃度（X）繪制標準曲線，得到線性方程和相關系數（r）。

從表1可以看出，在線性范圍內，5種氯代酰胺類除草劑的線性范圍為0.01～1.00 μg/mL，相關系數≥0.999，線性關系良好，異丙甲草胺表現為弱基質效應，乙草胺、丁草胺和丙草胺為中等基質效應，甲草胺為強基質效應。因此，準確定量時，需要配制基質標準曲線進行定量計算。

表1 5種氯代酰胺類除草劑的線性方程、相關系數、線性范圍、基質效應Tab.1 Linear equations，correlation coefficients（r）and matrix effect of the five amide herbicides

2.6.2 準確度和精密度 對空白洋蔥樣品添加不同水平的混合標準溶液，按照1.2.6 進行回收率和精密度試驗，每個添加水平做3 個平行樣品，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD），以信噪比（S/N）≥3 確定檢出限（LOD），以信噪比（S/N）≥10 確定定量限（LOQ）。

從表2 可以看出，5 種氯代酰胺類除草劑的平均回收率為85.7%～109.0%，RSD 為0.206%～4.710%，說明該方法回收率高，穩定性好，能達到殘留分析的要求。

表2 5種酰胺類除草劑的回收率、精密度、檢出限、定量限Tab.2 Limits of detection（LODs，S/N=3），limits of quantification（LOQs，S/N=10），recoveries and precisions of the five amide herbicides

3 結論與討論

在日常的殘留檢測中，洋蔥所含蒜氨酸類物質本身不會干擾檢測，但樣品被粉碎時，其內含的活性酶與底物接觸后產生大量的含硫化合物，該類物質與農藥性質相近，易與農藥一起提取出來，且含量遠遠高于農藥殘留的含量，在色譜和質譜測定中造成很強的背景干擾，通過一般的凈化方法很難將其除去。基于此，本試驗根據洋蔥含硫化合物產生的特點，在樣品未被完全破壞時，采用微波處理鈍化蒜酶的活性，切斷蒜酶催化蒜氨酸類物質轉化過程，避免含硫化合物的產生，從而將含硫化合物等基質干擾截留在樣品前處理階段，有效解決殘留測定時背景干擾問題。通過微波功率密度和微波時間密度2 個因素衡量微波處理對洋蔥雜質去除效果，降低背景干擾對檢測的影響，建立了微波處理-氣相色譜法測定洋蔥中5 種氯代酰胺類除草劑殘留的分析方法。在優化的色譜條件下，5 種氯代酰胺類除草劑色譜分離度好，峰型好，加標回收率結果滿意，精密度、重現性滿足農藥殘留要求，可滿足日常檢測。