石墨烯-聚苯胺修飾電極檢測雞蛋和牛奶中氯霉素

張義琴，吳鎖柱，郭紅媛

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

在養(yǎng)殖業(yè)中，為了防治致病菌引起的疾病，常常會在動物飼料或飲用水中添加抗生素類獸藥，但由于用藥不當(dāng)或動物處于特殊生理時期（如家禽產(chǎn)蛋、動物產(chǎn)奶等）不能及時代謝這些藥物，就會造成動物性食品中抗生素類獸藥的殘留[1]。殘留的獸藥會隨食物鏈進入消費者體內(nèi)，可能影響體內(nèi)正常代謝、引發(fā)人體過敏反應(yīng)、引起細菌耐藥性、產(chǎn)生特殊毒性等，對個人和社會造成嚴重危害[2]。獸藥殘留還會影響出口國在國際社會中的形象，因此，實現(xiàn)對獸藥殘留及時檢測具有重要意義[3]。

氯霉素（Chloroamphenicol，CAP）由于價格低廉且對多種動物的致病細菌有殺傷作用，可以有效治療多種疾病，曾用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但其在動物體內(nèi)不易降解且隨食物鏈蓄積，會對消費者的身體健康產(chǎn)生影響。有研究人員通過對小鼠灌胃給藥的試驗發(fā)現(xiàn)，CAP會阻礙小鼠胸腺細胞和造血細胞分化，從而影響免疫和造血功能，嚴重時可致死[4]。但近年來，在一些地方對雞蛋、牛奶、蜂蜜樣品進行抽檢時，時有CAP 檢出的報道[5-6]。因此，建立一種穩(wěn)定、靈敏的CAP 檢測方法是十分必要的。常用于CAP 檢測的方法有液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、酶聯(lián)免疫吸附測定法[8]、熒光免疫層析法[9]、比色法[10]、電化學(xué)檢測法[11]等。液相色譜及高效液相色譜法對試驗對象的分離度高、靈敏性好，可以實現(xiàn)幾種成分的同時檢測[12]，但存在基體干擾比較大、樣品滯留和記憶效應(yīng)、變異系數(shù)大等問題；酶法具有特異性好、準確、高效等優(yōu)點，這些特點使其適合于快速檢測大批量的樣本，但不足之處在于試劑盒保存不當(dāng)時，酶活性直接影響結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性；免疫學(xué)檢測具有操作比較方便、效價高的優(yōu)點[13]，但結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性，且單抗或多抗產(chǎn)生需要復(fù)雜過程。與以上方法相比，電化學(xué)檢測法具有設(shè)備簡單、試劑比較容易保存、儀器信噪比低、結(jié)果可靠等優(yōu)點，適于獸藥殘留的快速檢測。

聚苯胺是一種高分子有機導(dǎo)電材料，常用的聚合方法有化學(xué)聚合法和電化學(xué)合成法。吳學(xué)亮等[14]論述了聚苯胺作為電極修飾材料的制備方法及其優(yōu)勢與劣勢，并針對其劣勢提出相應(yīng)的解決方法。石墨烯比表面積大、導(dǎo)電性好，氧化石墨烯表面羧基位點之間關(guān)聯(lián)性很強，一個點氧化后苯環(huán)結(jié)構(gòu)遭到破壞，其他位點也相繼破壞，尤其在水分子參與下，氧化石墨烯碳氧鍵斷裂所需的能量與水分子的氫鍵相當(dāng)，所以可實現(xiàn)氧在水溶液中動態(tài)遷移[15]。陳瑩瑩等[16]對石墨烯制備方法進行了總結(jié)對比，并對石墨烯材料的應(yīng)用前景做出了積極的展望。田希雙[17]將石墨烯和聚苯胺結(jié)合制備了一種對污水中剛果紅和Cr（Ⅵ）具有強吸附性和脫附再生性的復(fù)合吸附劑。龍震等[18]研究表明，還原石墨烯/聚苯胺材料修飾后的電容器有更好的柔性，比電容也有所提高，說明石墨烯和聚苯胺協(xié)同可以有效改善電極材料的性能。

本試驗基于石墨烯-聚苯胺修飾玻碳電極建立一種靈敏檢測雞蛋和牛奶樣品中CAP的新方法，該方法操作簡單、結(jié)果可靠，可以為動物檢疫、食品安全控制提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以太谷縣家家利超市所售農(nóng)家產(chǎn)黃皮雞蛋和規(guī)格為1 L的德亞低脂高鈣牛奶為樣品。

1.2 試劑與儀器

CAP（98%）、濃硫酸、氧化石墨、殼聚糖（脫乙酰度≥95%）、苯胺（≥99.5%）、磷酸氫二鈉（99%）、碳酸氫鈉、碳酸鈉、乙酸（36%）、乙酸鈉、六水合氯化鋁（97.0%）、六水合氯化鐵（99%）、四水合氯化亞鐵（≥99.0%）、五水合硫酸銅（99%）、六水合氯化鎂（98.0%）、麥芽糖、乳糖、D-果糖（99%）、抗壞血酸（＞99.0%）、檸檬酸（≥99.5%）、甘露醇（98.0%）和D-山梨醇均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二氫鈉購自北京紅星化工廠。所有試劑均為分析純。

超聲清洗機（KX-1990QT，北京科璽世紀科技有限公司）、磁力攪拌器（85-1，杭州儀表電機有限公司）、電化學(xué)工作站（Autolab302N，Metrohm 瑞士萬通中國有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工作電極電化學(xué)行為 對直徑為3 mm的裸玻碳電極用0.30、0.05 μm 的氧化鋁濕粉進行機械打磨后用蒸餾水超聲清洗，然后將該電極置于鐵氰化鉀溶液中進行循環(huán)伏安掃描，直至氧化峰和還原峰之間的峰電位差在100 mV以內(nèi)時可進行后續(xù)試驗。設(shè)置石墨烯沉積條件為-1.3 V電位下沉積800 s、聚苯胺沉積條件為0.7 V 電位下沉積480 s，電沉積完成后將電極置于硫酸溶液中進行表征，觀察聚苯胺的電聚合程度。通過不同修飾電極在溶液中的電化學(xué)行為驗證石墨烯和聚苯胺沉積在玻碳電極表面后可以提高響應(yīng)電流。另外，通過控制循環(huán)伏安法（CV）掃速得到CAP 峰電流與掃速的關(guān)系，從而判斷藥物在該電極表面的控制過程。

1.3.2 CAP檢測 以石墨烯-聚苯胺修飾電極作為工作電極、銀/氯化銀（以3 mol/L氯化鉀為支持電解質(zhì)）作為參比電極、直徑0.5 mm 鉑絲為輔助電極組成三電極系統(tǒng)，將CAP除氧約10 min后進行一次CV和3 次方波伏安法（SWV）檢測，選擇500 μmol/L CAP對條件進行優(yōu)化。

1.3.3 鍍膜條件優(yōu)化 采用計時電流（i-t）法在電極表面先后沉積石墨烯和聚苯胺。設(shè)置單因素試驗，在-1.1～-1.5 V 范圍內(nèi)每間隔-0.1 V 設(shè)置電位梯度并固定其沉積時間為700 s來確定石墨烯電沉積的最優(yōu)電位值；在500～1 000 s 范圍內(nèi)每間隔100 s 設(shè)置時間梯度并固定沉積電位為-1.3 V 來確定石墨烯沉積時間的最優(yōu)值。同理，在0.50～0.75 V范圍內(nèi)每間隔0.05 V 設(shè)置電位梯度并固定沉積時間為540 s、在420～660 s范圍內(nèi)設(shè)置60 s為時間間隔且固定沉積電位為0.55 V 分別確定聚苯胺沉積電位和沉積時間的最優(yōu)值。

1.3.4 溶液條件優(yōu)化 在0.5 mol/L、pH 值為8.0 的PBS、乙酸-乙酸鈉和碳酸氫鈉-碳酸鈉3 種緩沖體系中選擇CAP峰電流最高的緩沖種類，再分別設(shè)置緩沖溶液濃度在0.1～0.6 mol/L 范圍內(nèi)的梯度、pH值在6.0～8.0范圍內(nèi)的梯度，確定緩沖體系的最佳濃度和pH值。

1.3.5 電化學(xué)性能考察 配制CAP在0～800 μmol/L濃度范圍的標(biāo)準溶液，根據(jù)峰電流值與濃度的線性關(guān)系得到一條標(biāo)準曲線，并計算出檢出限。根據(jù)優(yōu)化后的條件制備電極，分別用同一根修飾電極對500 μmol/L CAP平行檢測16次、用4根修飾電極對同濃度的CAP進行檢測，計算CAP峰電流值的相對標(biāo)準偏差值，得到同一電極和不同電極的重現(xiàn)性。用最優(yōu)條件下制備的修飾電極對500 μmol/LCAP還原峰電流值進行檢測，每3 d得到一個電流值，直到峰電流變化率高于120%或低于80%，得到該修飾電極的壽命。用方波伏安法考察常見物質(zhì)對該修飾電極檢測CAP的影響，通過該物質(zhì)和緩沖溶液電流的差值與CAP 和緩沖溶液電流差值的比值判斷該物質(zhì)是否對CAP檢測存在干擾，當(dāng)比值在±5%以內(nèi)，視為沒有干擾。

1.3.6 實際樣品檢測 將雞蛋打勻并超聲5 min后，在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min 的離心機中離心20 min，取上清液于小燒杯中。同條件下對沉淀物再次離心，將2 次取得的上清液合并作為雞蛋樣品溶液。對牛奶超聲處理10 min，獲得樣品溶液。雞蛋和牛奶樣品檢測前需要除氧10 min。通過對市售雞蛋和牛奶進行檢測，驗證修飾電極在實際樣品檢測中的可靠性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)由Excel處理，圖由Origin 6.1處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 石墨烯-聚苯胺修飾電極的電化學(xué)表征

從圖1可以看出，鐵氰化鉀在裸玻碳電極（GCE）上有1對氧化還原峰，氧化峰電流值為64.8 μA，還原峰電流值為-80.2 μA；與裸玻碳電極相比，鐵氰化鉀在石墨烯修飾玻碳電極（RGO/GCE）上的氧化峰電流值明顯提高，還原峰電流值略有下降，表明石墨烯沉積在玻碳電極表面可以加速體系中電荷的轉(zhuǎn)移，電極的導(dǎo)電性有所提高；與裸玻碳電極、石墨烯修飾玻碳電極相比，鐵氰化鉀在石墨烯-聚苯胺修飾玻碳電極（RGO/PAN/GCE）上的氧化還原峰均略向正電位方向移動，氧化峰電流達79.4 μA，還原峰電流達-99.1 μA，表明石墨烯、聚苯胺依次沉積在玻碳電極表面可以逐步提高電荷轉(zhuǎn)移速率，進而提高電極材料的響應(yīng)性。

從圖2 可以看出，在0～0.8 V 電位范圍內(nèi)可以觀察到明顯的4 個氧化峰（a、b、c、d）和4 個還原峰（a′、b′、c′、d′），每對氧化還原峰分別對應(yīng)完全還原態(tài)聚苯胺、翠綠亞胺鹽、苯胺黑、完全氧化態(tài)聚苯胺這4種狀態(tài)[19]，說明聚苯胺成功沉積到石墨烯修飾玻碳電極表面。

圖3是裸玻碳電極、石墨烯修飾電極、石墨烯-聚苯胺修飾電極分別作為工作電極在CAP 溶液中的電化學(xué)行為。在裸玻碳電極中，CAP在0.05 V出現(xiàn)1 個氧化峰、在-0.18、-0.70 V 分別出現(xiàn)還原峰。0.05 V 的氧化峰和-0.18 V 還原峰由可逆的硝羥基（-NHOH）和氨基（-NH2）反應(yīng)生成，在-0.70 V的還原峰是由硝基（-NO2）加氫還原產(chǎn)生的[20]。同時可以觀察到與裸玻碳電極相比，每增加一種修飾材料，CAP在-0.70 V左右還原峰電流的絕對值越大，說明修飾材料可以提高電極靈敏度，因此，更有利于CAP的檢測。

為探究CAP在電極表面的控制過程，以表面沉積了石墨烯和聚苯胺的玻碳電極為工作電極，通過在0.10～0.35 V/s 范圍內(nèi)設(shè)置掃速梯度，觀察掃速與CAP 在-0.70 V 處還原峰電流的關(guān)系。結(jié)果表明，峰電流隨掃速增大而逐漸降低，且與掃速呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝-83.666 9x—15.412 6（r＝-0.998），這說明CAP在該電極表面受吸附控制。

上述結(jié)果表明，可以將石墨烯、聚苯胺成功修飾到玻碳電極表面并提高對CAP的響應(yīng)，本試驗主要以CAP 在-0.70 V 處還原峰電流為依據(jù)，進行食品中CAP含量的檢測。

2.2 石墨烯沉積條件的優(yōu)化

在對石墨烯沉積電位進行優(yōu)化時，CAP的還原峰電流值在-1.5～-1.1 V范圍內(nèi)呈先上升后下降趨勢，在電位值為-1.3 V 時得到最大值；對沉積時間進行優(yōu)化時，峰電流在500～1 000 s 范圍內(nèi)電流值先上升后下降，在700 s 得到還原峰電流最大值。所以，石墨烯的最佳沉積條件為-1.3 V電位下沉積700 s。

2.3 聚苯胺沉積條件的優(yōu)化

在優(yōu)化聚苯胺沉積電位時，CAP的還原峰電流值在0.50～0.75 V 范圍內(nèi)呈先上升后下降趨勢，在0.55 V 時得到最大值；對沉積時間進行優(yōu)化時，在420～660 s 范圍內(nèi)CAP 的峰電流值在480 s 得到最大值。所以，聚苯胺的最佳沉積條件為0.55 V電位下沉積480 s。

2.4 緩沖溶液的優(yōu)化

在0.5 mol/L、pH 值為8.0 的PBS、乙酸-乙酸鈉和碳酸氫鈉-碳酸鈉3 種緩沖體系中，CAP 在PBS中的峰電流值最高；設(shè)置PBS 在0.1～0.6 mol/L 范圍內(nèi)的濃度梯度，CAP還原峰電流值先上升后下降，在濃度為0.5 mol/L 時取得最大值；pH 值在6.0～8.0，CAP 還原峰電流值隨pH 值增大而增大，而pH值在8.0～8.5 時電流值開始下降，pH 值為8.0 時得到峰電流的最大值。由此，得到CAP檢測的最優(yōu)緩沖體系是0.5 mol/L、pH值為8.0的PBS。

2.5 線性范圍和檢出限分析

從圖4 可以看出，CAP 還原峰電流隨其濃度的增大而增大，并且在0.3～800 μmol/L 濃度范圍內(nèi)還原峰電流與濃度存在2 段線性關(guān)系，檢出限為0.1 μmol/L。

2.6 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性試驗

用同一根修飾電極對500 μmol/L CAP 平行檢測16 次得到CAP 峰電流值的相對標(biāo)準偏差值（RSD）為1.7%，采用4 根修飾電極對同濃度的CAP進行檢測，峰電流值的RSD 為9.4%。這些結(jié)果說明，該電極具有良好的重現(xiàn)性。用最優(yōu)條件下制備的修飾電極對500 μmol/L CAP 還原峰電流值進行檢測，前24 d 的峰電流變化率在100%～120%，到第27 天時峰電流變化率高于120%，說明該電極壽命為24 d。

2.7 選擇性試驗

在最優(yōu)條件下制備電極并考察電極選擇性，結(jié)果表明，0.5 mmol/L 的Fe3+、Fe2+、Cu2+、Cl-、SO42-、麥芽糖、乳糖、甘露醇和D-山梨醇對500 μmol/LCAP檢測不存在干擾，0.05 mmol/L 的Mg2+、D-果糖、抗壞血酸和檸檬酸對500 μmol/L CAP 檢測也不存在干擾，該修飾電極對CAP 的檢測呈現(xiàn)出較高選擇性。

2.8 樣品檢測

采用該修飾電極對雞蛋樣品和牛奶樣品進行CAP殘留量檢測時，均未在這些樣品中檢測到CAP含量，說明這些樣品均符合食品安全要求。進一步對加入標(biāo)準溶液的雞蛋樣品和牛奶樣品進行檢測，測得它們的回收率分別為104.1%～120.3% 和84.6%～108.0%。

3 結(jié)論與討論

本試驗通過將三電極體系置于氧化石墨烯、苯胺的水溶液中，采用電化學(xué)方法將石墨烯、聚苯胺納米材料修飾在玻碳電極表面，建立了一種新型電化學(xué)傳感器，提高了工作電極對CAP 的響應(yīng)，改善了電極性能。以CAP在-0.70 V左右還原峰電流為依據(jù)對試驗條件進行了優(yōu)化，獲得石墨烯沉積的最優(yōu)條件為-1.3 V電位下沉積700 s、聚苯胺沉積的最優(yōu)條件為0.55 V 電位沉積480 s，最優(yōu)緩沖體系是0.5 mol/L、pH 值為8.0 的PBS。在最優(yōu)條件下考察電極性能，得到CAP 標(biāo)準溶液在0.3～800 μmol/L濃度范圍內(nèi)與還原峰電流值呈良好線性關(guān)系，檢出限為0.1 μmol/L，比張其美[21]、章錦涵等[22]報道的檢出限更低。同一根修飾電極平行檢測16次的RSD僅為1.7%，比李桂芳等[23]報道的同一電極重現(xiàn)性更好。同一根修飾電極對CAP峰電流檢測6 d的RSD為3.4%，比朱明芳等[24]報道的峰電流檢測7 d 的RSD 為4.5%低，表明電極穩(wěn)定性好；當(dāng)檢測時間為24 d 時，RSD 為6.8%，說明修飾電極壽命比較長。以常見金屬離子和有機物進行選擇性試驗，發(fā)現(xiàn)修飾電極具有良好的抗干擾效果。以市售雞蛋、牛奶為樣品，驗證該修飾電極對實際樣品中CAP殘留的檢測效果，得到雞蛋和牛奶樣品的回收率分別為104.1%～120.3%和84.6%～108.0%。用該傳感器對食品中CAP殘留量進行檢測時可以實現(xiàn)性能穩(wěn)定、結(jié)果可靠、節(jié)約成本的目標(biāo)，有望應(yīng)用于動物性食品安全的常規(guī)檢測。