精子形態畸形相關指數與夫精人工授精結局的關系

楊 岳 洪 洋 胡慧敏 丁彩飛

人工授精是臨床上用于治療不孕癥的常用手段，影響其受孕率的因素有很多。研究表明，精子形態畸形可能導致胚胎發育不良、胚胎種植率和懷孕率低以及反復流產[1-2]。精子存在多個部位同時畸形的情況，即多重精子缺陷，相關的評價指標主要有多重異常指數（MAI）、畸形精子指數（TZI）和精子畸形指數（SDI），其中研究者發現MAI 和TZI 與體內生育能力相關[3]，而SDI 與體外受精聯系緊密[4]。目前關于這三個精子形態多重畸形相關指標與人工授精臨床結局之間的相關性的研究仍較為缺乏。本研究擬探索男性精子形態畸形相關指數與夫精人工授精結局的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 連續選取2020 年2 月—2021 年5月在浙江省中西醫結合醫院生殖醫學科行夫人工授精的夫婦192 對，其中女性年齡（32.16±4.69）歲，男性年齡（34.57±5.19）歲。本研究通過醫院倫理委員會審核，倫理批號：【2021】快審（26）號，研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2納入及排除標準 納入標準：（1）所有患者按照相關規定行常規術前檢查，夫妻雙方年齡≤45 歲，雙方均無全身性疾病及傳染病；（2）女性經子宮輸卵管碘油造影檢查顯示至少一側輸卵管通暢，且通暢輸卵管側有優勢卵泡發育，子宮內膜情況良好；（3）正常性生活未避孕至少1 年及以上仍未受孕，雙方生殖系統相關檢查結果均顯示正常。排除標準：（1）年齡＞45 歲或在此年齡階段無生育要求；（2）生殖器官存在畸形或者先天性性腺發育不全；（3）合并其他器官嚴重原發病及精神病患者；（4）夫妻任何一方存在未得到充分治療并轉陰的生殖系統感染或性傳播疾病；（5）患者人工授精手術后失聯，無法追蹤妊娠情況。

1.3主要試劑及儀器 試劑與耗材：精子形態快速染液（Diff-Quik 染液）（深圳市博銳德生物科技有限公司，批號20201001），40%與80%密度梯度分離液（SAGE，批號20471648），精子培養液（SAGE，批號20471639），取精杯（BD Falcon 公司，批號9320028），離心管（BD Falcon 公司，批號21220023），玻片；儀器：普通光學顯微鏡（OLYMPUS，CX31），生物安全柜（Thermo，1300 SERIES A2）。

1.4精子形態分析 嚴格按照試劑盒說明書制片，使用Diff-Quik 染液進行快速染色。晾干后使用普通光學顯微鏡的油鏡（放大1000 倍）讀片，計數至少200 個精子，嚴格遵循《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》[5]的相關要求和規定判斷并統計精子形態情況，計算精子形態正常率、MAI、TZI 和SDI。精子形態示例具體見圖1：正常精子B；僅頭部畸形精子A、G、F、H；僅尾部畸形精子D；頭部與中段畸形精子C、J；頭部與尾端畸形精子L、K；中段及尾部畸形E；頭部、中段及尾部同時畸形I、O、P、M、N；過量殘留胞漿精子N。精子形態正常率=正常精子數/精子總數，MAI=缺陷總數/缺陷精子數（統計所有頭、中、尾部畸形，多部位畸形可重復計數），TZI=缺陷總數/缺陷精子數（頭、中、尾部畸形各記為1，過量殘留胞漿也記為1），SDI=缺陷總數/精子總數（頭部幾種缺陷合并記為1，中部尾部各記為1，過量殘留胞漿也記為1）。根據計數結果，精子形態正常率分為四組，具體為≥6%、4%～＜6%、2%～＜4%、＜2%；MAI 分為≥2.00、1.50～＜2.00、1.00～＜1.50 三組；TZI 分為兩組，1.50～2.00 和1.00～＜1.50；SDI 分為三組，分別是1.50～2.00、1.00～＜1.50 和0.50～＜1.00。

圖1 不同形態精子（Diff-Quik 快速染色法）

1.5行夫精人工授精手術 男方禁欲3～7 天，使用手淫法取精液于取精杯中，將精液置于37℃培養箱中直至完全液化，梯度液平衡至室溫，精子培養液放置5%CO2，37℃培養箱培養；吸取1mL 80%的密度梯度液小心加到1mL 40%密度梯度液下方；充分混合液化后的精液，加到40%密度梯度液上方；400g 離心20min，優質精子將集中于試管底部；棄去上層精漿和分離液，用3～4mL 培養液重懸精子沉淀團；再300g 離心5min，棄上清，加入0.4～0.5mL 精子洗液重懸精子沉淀團，獲得濃縮的精子懸液，放入37℃的CO2培養箱備用。根據女方具體情況選擇自然周期或促排后進行人工授精術，B 超監測到優勢卵泡，LH出現峰值，在優勢卵泡排出前后將精子懸液注入宮腔，并抬高臀部平躺1h。

1.6判定妊娠 術后10～18 天尿或血β-絨毛膜促性腺激素（β-HCG）值出現陽性結果，35 天左右B 超檢測到孕囊、卵黃囊及胎兒心跳搏動確定為臨床妊娠，統計各組妊娠率。

1.7統計學方法 應用統計軟件SPSS 19.0 分析相關數據，妊娠率作為描述性計數資料，采用卡方檢驗，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同精子形態正常率各組臨床妊娠率比較 不同形態正常率各組的妊娠率比較，差異無統計學意義（χ2=0.31，P=0.961），見表1。

表1 不同精子形態正常率各組臨床妊娠率比較（例，%）

2.2不同精子MAI 各組妊娠率比較 各組間妊娠率比較，差異無統計學意義（χ2=1.86，P=0.402），見表2。

表2 不同精子MAI 各組妊娠率比較（例，%）

2.3不同TZI 各組妊娠率比較 不同TZI 組間妊娠率比較，差異無統計學意義（χ2=0.139，P=0.712），見表3。

表3 不同TZI 各組妊娠率比較（例，%）

2.4不同SDI 各組妊娠率比較 不同SDI 各組妊娠率差異有統計學意義（χ2=8.12，P=0.022），其中1.50～2.00 組和1.00～＜1.50 組之間無差異，但0.50～＜1.00組與前兩組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表4 SDI 各組妊娠率比較（例，%）

3 討論

對于有生育要求的不孕不育癥夫婦，臨床上常用的輔助生殖技術是人工授精手術，但人工授精受孕成功率一般在8%～22%之間[6]。造成人工授精成功率較低的因素有很多，其中男性因素主要是精液情況和精子質量，精子形態學是評估男性精子質量的重要指標之一，精子的形態畸形會從多方面影響受孕，例如影響精子識別、結合卵子透明帶的能力和頂體反應[2]。有研究發現，精子畸形率程度與胚胎發育潛能呈負相關關系，而與受孕后發生早期自然流產風險表現為正相關關系，因此會影響體外授精的成功率[7-8]。有報道顯示，MAI、TZI、SDI 在特發性少弱畸形精子癥患者的檢測中均與其精子中段、尾部異常百分率呈正相關[9]，也有研究表明，SDI 與精子密度、活力與前向運動率之間存在負相關關系，與體外授精成功率也呈負相關關系[4，10]，而對于三者與人工授精臨床結局之間的相關性，目前還未有報道。

本研究發現，精子形態正常率≥6%組的妊娠率較其他組略高，但差異無統計學意義；不同MAI 和TZI 各組間也無顯著性差異；但SDI 值0.50～＜1.00 組的妊娠率明顯增高（P＜0.05）。以上結果說明暫未發現精子形態正常率、MAI、TZI 對不孕患者人工授精術后妊娠率具有預測作用，但SDI 對預測人工授精術后妊娠率具有一定指導意義。這一方面可能由于樣本量有限，MAI、TZI 相關分組的樣本數存在不足；另一方面也可能由于精子形態正常率只關注正常精子所占總數比例，而MAI、TZI 反映的是畸形精子的缺陷程度，SDI 則可以反映各種缺陷精子占精子總數比例，可代表樣本總體的多重缺陷情況，并且SDI 的缺陷精子計數包含對過量殘留胞漿的計數，已有研究者發現過量殘留胞漿會造成精子功能缺陷進而影響受孕[11]。

綜上所述，我們認為SDI 對人工授精術后的妊娠率具有一定的預測作用，鑒于本研究樣本量的局限，后期可繼續增加樣本量，進一步探索精子多重畸形相關指標與人工授精妊娠率的關系，能夠有助于臨床更好把握適應證，提高人工授精的成功率。