小干擾RNA修飾BMSCs分泌的外泌體對CCI動物模型修復的促進作用研究

項 爍 張 弛

·論 著·

小干擾RNA修飾BMSCs分泌的外泌體對CCI動物模型修復的促進作用研究

項 爍 張 弛

浙江大學醫學院附屬金華醫院（金華市中心醫院）康復科，浙江金華 321000

探討Piezo2沉默質粒轉染骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）來源外泌體修復慢性壓迫性神經損傷（chronic constriction injury，CCI）動物模型的相關作用。以成熟的大鼠為實驗對象，提取大鼠的骨髓組織培養原代BMSC，超速離心法提取Piezo2基因siRNA沉默質粒轉染的BMSC來源外泌體，用手術方案構建CCI動物模型，根據實驗目的將入組的SD大鼠分成模型組、BMSC組和外泌體組，利用熒光定量聚合酶鏈反應和免疫熒光染色法檢測Piezo2、NeuN、IbA1和膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的mRNA相對表達量。原代BMSC的CD29、CD90和CD105蛋白呈陽性，而CD45、CD34和CD11b呈陰性。而外泌體組動物（dorsal root ganglion，DRG）組織中脊髓背角小膠質細胞的激活明顯弱于模型組和BMSC組。外泌體組Piezo2的mRNA相對表達量明顯低于BMSC組和模型組（<0.05），外泌體組NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達量明顯高于BMSC組（<0.05）。Piezo2沉默質粒轉染BMSC來源外泌體可以促進CCI的修復，值得進一步推廣。

Piezo2；骨髓間充質干細胞；外泌體；慢性壓迫性神經損傷

慢性壓迫性神經損傷（chronic constriction njury，CCI）是臨床的常見病、多發病，多見于各種慢性損傷性疾病[1,2]。Piezo2蛋白是目前的“明星分子”，研究發現，Piezo2蛋白表達量與本體感覺、痛覺和腫瘤相關痛覺有關[3,4]。Piezo2蛋白可分布于皮膚中，感受體外壓力的變化，也可分布于肺上皮組織中，與呼吸功能相關，也可分布于血管內皮中，與血液流動、血壓的變化密切相關[5,6]。本研究中，以Piezo2作為研究切入點，探討siRNA-Piezo2沉默質粒對CCI動物模型的修復作用，以期為臨床上慢性壓迫性神經損傷的患者提供新的治療方案和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和實驗細胞

實驗動物選擇12只SPF級SD大鼠，周齡（5.36±1.43）周，體質量（349±55）g，購自浙江省中醫藥大學實驗動物中心[實驗動物許可證號：SCXK（浙）2021-1010]；飼養于金華市實驗動物中心內[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2021- 0024]。實驗開始前于（22±2）℃、50%～60%濕度、12h明暗交替的環境中適應性飼養1周，期間自由飲水進食。實驗細胞為骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），取自大鼠股骨側的骨髓組織，采用原代培養法。本研究方案獲得金華市中心醫院倫理委員會批準[（倫理審批號：（研）2021-109-47）]。

1.2 BMSC的提取和鑒定

以成熟的SD大鼠為實驗對象，采用腹腔注射3%水合氯醛0.4ml/kg行麻醉，然后骨髓穿刺針提取后腿大腿骨內骨髓組織，采用差速培養法培養原代細胞，加入含20%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃，5%CO2的培養箱中，培養原代BMSC細胞。利用流式細胞儀方法鑒定原代BMSC細胞定。

1.3 Piezo2基因siRNA沉默質粒的構建和慢病毒轉染

Piezo2基因siRNA沉默質粒的構建和轉染委托上海吉瑪生物試劑有限公司完成，利用慢病毒轉染BMSC，倒置熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉染率。

1.4 Piezo2基因siRNA沉默質粒轉染BMSCs的外泌體的提取和鑒定

采用超速離心法收集細胞的外泌體。利用透射電子顯微鏡法檢測外泌體的囊泡結構和直徑鑒定外泌體，利用蛋白質印跡法檢測外泌體的分子標志物CD63、CD9和CD81的表達鑒定。

1.5 CCI動物模型的構建

構建CCI動物模型，以SD大鼠為研究對象，腹腔注射3%水合氯醛進行麻醉，采用下肢大腿背側入路，鈍性分離股二頭肌，充分暴露坐骨神經主干，通過利用羊腸線環扎坐骨神經的方法構建CCI動物模型，碘伏消毒后逐層縫合切口。

1.6 CCI動物模型構建成功的檢測

采用行為學的觀察方法對CCI動物模型是否成功進行檢測，術后2周每隔1～2d觀察大鼠的步態和左后肢的姿勢、局部皮膚及肌肉張力的改變程度、是否存在舔咬肢體現象等。大鼠術后1～2周內，下肢行走無力，左側足趾并攏輕度外翻，經常懸空不敢著地；站立時以右后肢持重，左后肢抬起并緊貼腹部；術后2周，左后肢出現較明顯的肌肉萎縮，說明CCI動物模型構建成功。

1.7 實驗動物分組

將入組的SD大鼠分成模型組、BMSC組和外泌體組，每組SD大鼠各5只。模型組SD大鼠均采用手術方案構建CCI動物模型，BMSC組SD大鼠構建CCI動物模型后，局部注射BMSC細胞，劑量5×105個/ml，注射量0.5ml，3次/周；外泌體組D大鼠構建CCI動物模型后，局部注射外泌體0.5ml，3次/周。

1.8 免疫熒光檢測

所有實驗動物處理4周后，無痛苦處死后，收集背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）組織，制成蠟塊，冰凍切片機處理后，取出切片，用PBS沖洗后，10%山羊血清常溫封閉30min，加入神經元特異核蛋白（neuronal nuclei antigen，NeuN），離子鈣結合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）和膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）一抗，4℃冰箱濕盒孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5min，避光條件下加入二抗IgG-FITC，室溫孵育30min，棄掉二抗溶液后，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚[2-(4-Amidinophenyl)-6- indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI）]DAPI試劑，避光孵育5min，PBS清洗3次，每次5min，加入防淬滅劑后，加入蓋玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.9 熒光定量聚合酶鏈反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測目的基因的mRNA相對表達量

利用Trizol法提取上述3組DRG組織中的總RNA，然后用反轉錄試劑盒將總RNA反轉為cDNA。采用熒光定量PCR試劑盒分析上述各組DRG組織中的DNA樣本，采用2-△△CT法進行分析。引物設計由上海生工公司設計并檢測合格。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 BMSC的培養和鑒定

原代BMSC呈鋪路石樣分布，細胞形態不規則，流式細胞儀檢測結果顯示，CD29、CD90和CD105呈陽性，而CD45、CD34和CD11b呈陰性，證明培養的細胞為BMSC，可作為種子細胞存在，見圖1。

2.2 慢病毒介導siRNA-Piezo2沉默質粒轉染BMSC結果

慢病毒可將siRNA-Piezo2沉默質粒轉染BMSC，轉染成功后細胞即可檢測到綠色熒光，轉染效率=熒光視野下細胞數/白光視野下細胞數×100%，結果顯示，慢病毒介導siRNA-Piezo2沉默質粒轉染BMSC轉染效率為（75.33±6.13）%。

2.3 BMSCs來源外泌體的鑒定結果

透射電子顯微鏡結果顯示，BMSCs來源外泌體為杯口狀結構見圖2A，蛋白質印跡法可以檢測到外泌體的分子標志物CD63、CD9和CD81的表達見圖2B，外泌體直徑150～180nm，見圖2C。

圖1 BMSC的流式細胞儀鑒定結果

圖2 BMSCs來源外泌體的鑒定結果

A.外泌體的囊泡結構（透射電子顯微鏡，×800）；B.免疫蛋白印跡法檢測外泌體的CD63、TSG101表達；C.外泌體的囊泡直徑在100nm附近

2.4 免疫熒光染色結果顯示脊髓背角小膠質細胞的激活作用

CCI模型組動物DRG組織中脊髓背角小膠質細胞廣泛激活，BMSC組動物DRG組織中脊髓背角小膠質細胞的激活明顯弱于模型組，而外泌體組動物DRG組織中脊髓背角小膠質細胞的激活明顯弱于模型組和BMSC組，鎮痛效果較好，見圖3。

2.5 外泌體組SD大鼠DRG組織中Piezo2、NeuN、IbA1和GFAP的表達

Peizo2蛋白與IbA1蛋白的染色合并后呈棕色，在DRG組織中的表達部位重合度較高。而Peizo2蛋白與NeuN蛋白和GFAP蛋白的染色合并圖層界限較為清楚，表達部位重合度較低，見圖4。

圖3 免疫熒光染色結果顯示脊髓背角小膠質細胞的激活作用（倒置熒光顯微鏡，×100）

注：綠色熒光代表脊髓背角小膠質細胞的激活，綠色熒光越多說明激活的脊髓背角小膠質細胞越多，表示疼痛越劇烈

圖4 外泌體組SD大鼠DRG組織中Piezo2、NeuN、IbA1和GFAP的表達（倒置熒光顯微鏡，×100）

2.6 RT-PCR檢測結果

各組SD大鼠DRG組織中Piezo2、NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達量結果顯示，模型組和BMSC組中Piezo2的mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（>0.05）。BMSC組NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達量明顯高于模型組（<0.05），外泌體組Piezo2的mRNA相對表達量明顯低于BMSC組和模型組（<0.05），外泌體組NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達量明顯高于BMSC組（<0.05），見表1。

3 討論

CCI是臨床上的常見病、多發病，多見于腰椎間盤突出癥[7,8]。干細胞為有效的治療方案，有研究認為，干細胞對于CCI具有一定的修復作用[9,10]。但是干細胞的分化方向不定，療效不確定，因此，如何尋找更加的治療方案是目前研究的重點和熱點問題。

新型機械敏感性離子通道蛋白Piezo2在多種生理過程中發揮作用，如機械痛、排尿、呼吸、血壓、骨骼重塑等[11,12]。Piezo2主要與觸覺、本體覺、內臟覺機械力感知相關，因此，在神經感知和修復方面具有較大的潛力。研究證明，Piezo2蛋白有利于保持血壓穩定，可能對于開發治療心力衰竭的新藥物具有一定的作用[13]。也有研究認為Piezo2與觸摸超敏痛密切相關，且Piezo2的表達集中在外周感覺神經元，因此，在周圍神經損傷修復方面，Piezo2蛋白具有較大的潛力[14]，因此，本研究通過探討Piezo2在CCI動物模型中的修復作用，以期為臨床上CCI患者的治療提供思路。

表1 RT-PCR檢測結果（）

干細胞在神經修復領域方面的探討較多，多利用干細胞的多向分化潛能和種子細胞特性，在一定程度上彌補了神經細胞的壞死，起到一定的恢復作用。但是由于干細胞的分化方向不定，增殖能力欠缺，因此，在干細胞針對神經組織的修復無法達到預期的效果。為了進一步優化種子細胞的作用，對干細胞進行基因修飾是當前研究的熱點問題。李文凱等[15]將嘌呤受體P2Y2的siRNA沉默質粒轉染骨髓間充質干細胞，結果證明，嘌呤受體P2Y2的siRNA沉默質粒可以促進BMSC的分化，對于增強BMSC的分化潛能具有十分重要的作用。本研究中利用siRNA-Piezo2沉默質粒轉染BMSC，以期對BMSC的成神經細胞分化中起到一定作用。

外泌體是近幾年較熱門的領域，相較于干細胞，外泌體可以獨自攜帶遺傳信息，發揮持久的誘導作用，其優點是可以擺脫細胞的死亡周期，提高誘導基因分子的濃度。潘韻芝等[16]將ANXA2基因過表達處理，然后通過慢病毒轉染腫瘤干細胞，觀察其對肝癌的增殖和凋亡等生物學行為的影響，結果證明，利用基因修飾工具調控某一基因的表達可以起到一定的作用。因此，本研究利用siRNA質粒構建Piezo2的沉默質粒，通過慢病毒轉染BMSC，然后利用CCI動物模型進行驗證，結果顯示，CCI模型組動物DRG組織中脊髓背角小膠質細胞廣泛激活，說明疼痛較劇烈，BMSC組動物DRG組織中脊髓背角小膠質細胞的激活明顯弱于模型組，而外泌體組動物DRG組織中脊髓背角小膠質細胞的激活明顯弱于模型組和BMSC組，說明鎮痛效果較好，分析其原因，考慮可能與Piezo2的siRNA質粒可以誘導BMSC的成神經細胞分化有關。

本研究利用RT-PCR和免疫熒光染色對CCI動物模型DRG組織中的修復作用，檢測NeuN、IbA1和GFAP的表達，結果表明，外泌體組NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達量明顯高于BMSC組（<0.05），結果說明，外泌體的NeuN、IbA1和GFAP的相對表達量明顯增加，進一步說明siRNA- Piezo2轉染BMSC后可以促進其對CCI動物模型的修復作用。

綜上，Piezo2沉默質粒轉染BMSC來源外泌體可以促進CCI的修復，值得進一步推廣。

[1] 胡安全, 王正安, 秦力, 等. 定向誘導為神經元樣細胞的間充質干細胞對大鼠坐骨神經損傷的修復作用及生物力學評價[J]. 中國現代醫生, 2021, 59(15): 6-9.

[2] Medeiros P, Dos Santos IR, Júnior IM, et al. An adapted chronic constriction injury of the sciatic nerve produces sensory, affective, and cognitive impairments: A peripheral mononeuropathy model for the study of comorbid neuropsychiatric disorders associated with neuropathic pain in rats[J]. Pain Med, 2021, 22(2): 338-351.

[3] Ranade SS, Woo SH, Dubin AE, et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice[J]. Nature, 2014, 516(7529): 121-125.

[4] Handler A, Ginty DD. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation[J]. Nat Rev Neurosci, 2021, 22(9): 521-537.

[5] Huang Z, Sun Z, Zhang X, et al. Loss of stretch- activated channels, PIEZOs, accelerates non-small cell lung cancer progression and cell migration[J]. Biosci Rep, 2019, 39(3): 1679-1683.

[6] Anderson EO, Schneider ER, Bagriantsev SN. Piezo2 in cutaneous and proprioceptive mechanotransduction in vertebrates[J]. Curr Top Membr, 2017, 79(3): 197-217.

[7] Sun J, Li JY, Zhang LQ, et al. Nrf2 Activation attenuates chronic constriction injury-induced neuropathic pain via induction of PGC-1α-mediated mitochondrial biogenesis in the spinal cord[J]. Oxid Med Cell Longev, 2021, 168(88): 115-127.

[8] Chu LW, Cheng KI, Chen JY, et al. Loganin prevents chronic constriction injury-provoked neuropathic pain by reducing TNF-α/IL-1β-mediated NF-κB activation and schwann cell demyelination[J]. Phytomedicine, 2020, 67(45): 153-166.

[9] 路曉淼, 姜晟, 李孝亮, 等. 神經生長因子對兔牙髓干細胞體外增殖, 成骨分化影響的實驗研究[J]. 蚌埠醫學院學報, 2021, 46(1): 4-7.

[10] 朱雪芬, 黃成, 丁健, 等. 膠質細胞神經營養因子誘導骨髓間充質干細胞向功能性神經元分化的機制[J]. 中國組織工程研究, 2021, 25(7): 7-13.

[11] Song Y, Li D, Farrelly O, et al. The mechanosensitive ion channel piezo inhibits axon regeneration[J]. Neuron, 2019, 102(2): 373-389.

[12] Coste B, Houge G, Murray MF, et al. Gain-of-function mutations in the mechanically activated ion channel PIEZO2cause a subtype of distal arthrogryposis[J]. PNAS, 2013, 110(12): 4667.

[13] Wang J, Hamill OP. Piezo2-peripheral baroreceptor channel expressed in select neurons of the mouse brain: A putative mechanism for synchronizing neural networks by transducing intracranial pressure pulses[J]. J Integr Neurosci, 2021, 20(4): 825-837.

[14] Zeng WZ, Marshall KL, Min S, et al. PIEZOs mediate neuronal sensing of blood pressure and the baroreceptor reflex[J]. Science, 2018, 362(6413): 464-467.

[15] 李文凱, 張英馳, 楊勇, 等. 嘌呤受體P2Y2在骨髓間充質干細胞成骨和成脂分化中的作用[J]. 中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志, 2021, 14(1): 8-11.

[16] 潘韻芝, 馬賽, 曹凱悅, 等. 高表達ANXA2肝癌干細胞外泌體對肝癌細胞惡性生物學特性的調控作用[J]. 中國腫瘤, 2019, 11(4): 7-12.

Effect of small interfering RNA modified exosomes secreted by BMSCs on the repair of CCI animal model

Department of Rehabilitation, Jinhua Hospital affiliated to Zhejiang University Medical College (Jinhua Municipal Central Hospital), Zhejiang, Jinhua 321000, China

To explore the related role of the secrete derived from bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) transfected with Piezo2 silencing plasmid in repairing the animal model of chronic compression injury (CCI).The mature SD rats were taken as the experimental object. The bone marrow tissue of SD rats was extracted and the primary BMSC was cultured. Extraction of BMSC derived exosomes transfected with Piezo2 gene siRNA silencing plasmid by ultracentrifugation. The CCI animal model was constructed by surgical scheme. According to the experimental purpose, the SD rats were divided into model group, BMSC group and exosomes group. The relative mRNA expressions of Piezo2, NeuN, Iba1 and GFAP were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunofluorescence staining.The primary BMSCs were positive for CD29, CD90 and CD105 proteins, but negative for CD45, CD34 and CD11b. The activation of spinal dorsal horn microglia in the DRG tissue of animals in the BMSC group was significantly weaker than that in the model group, while the activation of spinal dorsal horn microglia in the DRG tissue of animals in the exosome group was significantly weaker than that in the model group and BMSC group, indicating that the analgesic effect was better. The relative expression of Piezo2 mRNA in exosome group was significantly lower than that in BMSC group and model group (<0.05), and the relative expression of NeuN, Iba1 and GFAP mRNA in exosome group was significantly higher than that in BMSC group (<0.05).Transfection of BMSC derived exosomes with piezo2 silencing plasmid can promote the repair of chronic compression injury (CCI), which is worthy of further promotion.

Piezo2; Bone marrow mesenchymal stem cells; Exosomes; Chronic compressive nerve injury

R644

A

1673-9701(2022)36-0001-05

浙江省醫藥衛生科技項目（2020KY343）

項爍，電子信箱：Professorllii@163.com

（2022–05–22）

（2022–09–26）