PCDGF和HIF1-α在卵巢癌中的表達及意義

宋玉霞 趙芳 趙濤 周莎莎 王雪娟 郭樺

卵巢癌在女性生殖道惡性腫瘤中致死率最高，由于沒有早期癥狀，>70%的患者在診斷時已經處于晚期[1]。雖然隨著徹底的腫瘤細胞減滅術(R0)+鉑類為基礎的聯(lián)合化療方案推廣，卵巢癌患者生存有所改善，但晚期患者5年生存率仍徘徊在32%～46%[2]。因此，進一步探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移中相關因子的變化對其早期診斷及預后具有重要意義。畸胎瘤細胞源性生長因子(PC cell-derived growth factor，PCDGF)是顆粒蛋白超家族成員之一，其表達升高可促進腫瘤的發(fā)生浸潤、轉移及血管生成，研究證實PCDGF與肺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[3,4]。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)作為腫瘤微環(huán)境中重要細胞缺氧感受分子，介導了大部分的缺氧應激反應，在缺氧環(huán)境下能誘導多種蛋白表達，從而促進腫瘤生長[5]。本研究通過對照研究，觀察卵巢癌組織中PCDGF及HIF-1α的表達水平，探討二者表達的相關性及其與卵巢癌患者臨床、預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月至2015年9月在石家莊市人民醫(yī)院婦科手術切除的卵巢癌組織82例，選取因子宮脫垂行全子宮雙附件切除或BRCA基因檢測突變陽性行預防性雙附件切除者的正常卵巢組織33例，年齡35～75歲，平均(50.0±12.3)歲;年齡 <50歲39例，年齡≥50歲43例；根據FIGO分期標準：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期49例，Ⅳ期9例；根據腫瘤的組織學分化程度區(qū)分：高分化12例，中分化50例，低分化20例；根據組織學分類區(qū)分：漿液性56例，黏液性15例，子宮內膜樣11例。正常卵巢組患者年齡39～70歲，平均(52.0±11.6)歲，2組患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。患者臨床資料完善、病理診斷明確，且均排除其他系統(tǒng)腫瘤，術前均未接受任何抗腫瘤治療。所有存檔蠟塊組織重新做常規(guī)HE染色且由2名高級職稱病理醫(yī)生復查篩選后方可入組，本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準，且患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆抗體Anti-HIF-1α抗體[EP1215Y](ab51608)、Anti-PCDGF抗體[EPR15864](ab208777)均購自Abcam公司，DAB顯色劑、EDTA抗原修復液、二抗SP-9001試劑盒等均購于北京中杉金橋。采用顯微鏡及多功能圖像分析工作站(OLYMPUS，CX21，日本)進行閱片及圖像采集。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化：采用S-P免疫組織化學法，檢測PCDGF蛋白及HIF-1α蛋白的表達情況，參照試劑盒說明書操作。主要步驟：石蠟組織連續(xù)切片4 μm、二甲苯脫蠟后3%H2O2滅活，EDTA(pH值=8.0)抗原修復液進行修復，10%山羊血清封閉，加一抗(PCDGF兔抗人多克隆抗體稀釋比例1∶100、HIF-1α兔抗人單克隆抗體稀釋比例1∶250)，4℃孵育過夜；PBS液適當沖洗后滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、封片。

1.3.2 結果判讀：PCDGF蛋白主要表達于細胞膜和細胞漿，陽性表現(xiàn)為黃色、棕黃色顆粒；HIF-1α蛋白主要表達在細胞質和細胞核，以出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性反應。免疫組化染色結果半定量分析計數(shù)系統(tǒng)，根據染色陽性細胞百分率和染色強度綜合計分進行結果判斷。由2名高級職稱病理醫(yī)生采用雙盲法并獨立對切片進行染色評估，每張切片在高倍鏡下(200 ×)隨機觀察10個視野。細胞染色程度: 藍色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，依次評為0、1、2、3分; 陽性細胞數(shù):將陽性細胞比值的0～5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、> 75%分別評為0、1、2、3、4分。將兩項得分相乘后的分值為每張切片的最終評分(0～12分): 0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～8分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。最終將免疫組化結果劃分2組: 低表達組(-～+)和高表達組(++～+++)，其中以高表達組之和計算陽性表達率。

1.4 隨訪 采用電話或門診隨訪。隨訪時間為術后3～80個月，中位隨訪時間46個月，隨訪終點事件為患者死亡或者到達隨訪截止時間(2020年10月)。

2 結果

2.1 PCDGF和HIF1-α在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達 PCDGF以細胞膜和細胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性反應，在正常卵巢組織中的陽性表達率低于卵巢癌組織(P< 0.001)；HIF1-α陽性表達表現(xiàn)為細胞漿和細胞核內出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，在正常卵巢組織中的陽性表達率低于卵巢癌組織(χ2=7.730，P=0.005)。見圖1，表1。

圖1 PCDGF和HIF1-α在卵巢癌組織中的蛋白表達(SP×200)

表1 PCDGF和HIF1-α在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達 例(%)

2.2 PCDGF和HIF1-α的表達與卵巢癌臨床病理特征的關系 PCDGF的高表達與患者腫瘤FIGO分期呈正相關(P=0.029)，而與患者年齡、腫瘤類型及腫瘤分化程度無相關性(P> 0.05)；HIF1-α的高表達與FIGO分期呈正相關(P=0.005)，在漿液性腫瘤組織中的表達高于其他類型腫瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)，而與患者年齡、腫瘤分化程度無關,差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。見表2。

表2 PCDGF和HIF1-α的表達與卵巢癌患者臨床病理特征的關系 例

2.3 卵巢癌中PCDGF與HIF1-α表達的相關性 Spearman等級相關檢驗結果表明，卵巢癌中PCDGF和HIF1-α蛋白表達呈正相關(r=0.317，P=0.004)。見表3。

表3 PCDGF與HIF1-α表達的相關性 例

2.4 PCDGF與HIF1-α的表達水平與卵巢癌預后的關系 隨訪5年，82例患者整體生存率為28.1%(23/82)。PCDGF高表達組5年生存率為23.4%(15/645)，低表達組5年生存率為38.9%(7/18)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HIF-1α高表達組5年生存率為17.0%(8/47)，低表達組5年生存率為48.2%(17/35)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 PCDGF與HIF1-α的表達與卵巢癌患者預后的關系(Kaplan-Meier法)

3 討論

本研究從缺氧這一腫瘤特有的微環(huán)境出發(fā)[6-8]，通過檢測上皮性卵巢腫瘤組織中PCDGF、HIF-1α的表達，探討PCDGF、HIF-1α與卵巢癌病理特征及臨床預后之間的關系；

PCDGF作為一種自分泌生長因子與多種腫瘤的發(fā)生、侵襲及細胞存活密切相關。黃權生等[9]研究結果顯示PCDGF在肺癌患者中高表達。宋鵬等[4]研究表明在鼻咽癌組織中PCDGF呈高表達，且其表達水平與患者差的預后相關。馬明忠等[10]在喉鱗癌Hep-2細胞中抑制PCDGF的表達后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖和侵襲能力受到抑制，細胞凋亡明顯增加，以上結果提示PCDGF在多種腫瘤惡性演進中扮演著重要角色。本研究結果表明在卵巢癌組織中PCDGF陽性表達率為78.8%，明顯高于正常卵巢組織，且高表達組患者5年生存率明顯低于低表達組，與宋鵬等[4]研究結果類似。進一步分析表明PCDGF高表達與腫瘤分期呈正相關，據此我們推測卵巢癌組織中PCDGF高表達可促進腫瘤的侵襲、轉移導致腫瘤臨床分期進展，并最終影響卵巢癌患者預后。

HIF介導了大部分的缺氧應激反應，根據α亞基的不同，HIF-α可以分為HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，其中HIF-1α是調控缺氧應激的主要成員[11，12]。Magliulo等[13]發(fā)現(xiàn)阻斷HIF-α表達可以抑制裸鼠移植瘤的生長。HIF-1不僅能降低腫瘤細胞代謝的氧耗量，調節(jié)糖酵解作用酶，使其能在缺氧條件下以不耗氧的方式合成三磷酸腺苷，從而促進腫瘤細胞的生長，而且可參與上調血管內皮生長因子(VEGF)的表達，促進血管內皮細胞的生長及細胞外基質的形成及促進與癌相關的成纖維細胞的聚集，為腫瘤的轉移侵襲創(chuàng)造條件，同時可影響腫瘤的免疫調節(jié)。另外，HIF-1α還可以上調P-gp及多藥耐藥(MDR)基因及耐藥蛋白的表達，引起腫瘤耐藥[14]。已發(fā)現(xiàn)HIF-1α在很多腫瘤中高表達，如乳腺癌、腎癌及結腸癌。近年來有關HIF-1α在卵巢癌中的表達及意義研究也成為熱點[15]，本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在卵巢癌組織中高表達主要見于漿液性腫瘤及分期較晚者，提示HIF-1α蛋白的表達與卵巢上皮性癌的潛在惡性生物學行為密切相關，進一步預后分析表明HIF-1α高表達組患者預后明顯差于低表達組。施宣忍等[16]研究表明HIF-1α通過調控MMP13表達增強缺氧環(huán)境下卵巢癌細胞的侵襲能力。韓煜雯等[17]研究表明，HIF-1α可與BMP4協(xié)同作用，參與缺氧微環(huán)境的調控，促進上皮性卵巢癌侵襲和轉移。這與本研究結果一致。因此，推測HIF-1α可以作為卵巢癌診斷的生物學標志物，并且可以預測卵巢癌患者的預后。

同時，本研究表明卵巢癌組織中PCDGF和HIF1-α蛋白表達呈正相關，這與前期宋鵬等[4]在鼻咽癌中的研究是一致的，提示二者間存在密切關系，但其具體機制尚需進一步研究。

綜上所述，卵巢癌組織中PCDGF和HIF1-α表達升高，且其表達水平與患者臨床、預后關系密切，表達升高提示患者預后不佳。