廣州市沙田檸檬炭疽病病原菌種類的分子鑒定

崔一平，彭埃天，宋曉兵，馮冠杰，黃 峰，陳 霞，凌金鋒，程保平

（1.廣東省農業科學院植物保護研究所/農業農村部華南果蔬綠色防控重點實驗室/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.廣州市白云區沙田檸檬農產品專業合作社，廣東 廣州 510550）

【研究意義】沙田檸檬〔Citrus limon（L.）Burm.f.,Shatian lemon〕又稱香水檸檬、香櫞檸檬，是蕓香科柑橘屬常綠小喬木，因主要種植于廣東省廣州市白云區沙田村而得名。由于沙田村獨特的氣候條件，該地及所產檸檬已于2009 年通過無公害的產地認證及產品認證，屬于無公害食品、有機食品和國家地理標志保護產品［1］。檸檬炭疽病是影響檸檬產量和品質的主要病害之一，多發生在高溫多雨地區，而廣州氣候常年高溫多雨，極易引起該病的發生；炭疽病主要危害柑橘類植物的葉片、樹梢、花和果實等部位，潛伏在果實中的病原菌也可在儲運期繼續對果實造成危害［2］。研究表明，不同的炭疽病病原菌對同一化學藥劑的敏感性也不同，因此明確引起沙田檸檬炭疽病的病原菌種類對精準防控該病害具有重要的現實意義［3-5］。【前人研究進展】柑橘炭疽病主要由炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）真菌引起。目前已報道的引起柑橘炭疽病的病原菌主要有炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）、喀斯特炭疽菌（C.karstii）、果生刺盤孢菌（C.fructicola）和暹羅刺盤孢菌（C.siamense）等［4-6］。本課題組調查發現，沙田村檸檬種植園沙田檸檬上的主要病害有炭疽病、瘡痂病、黃龍病等，主要害蟲有紅蜘蛛、薊馬、葉螨等，除薊馬和炭疽病對沙田檸檬的產量和品質造成一定危害外，其他病蟲害危害程度均較輕［7］。【本研究切入點】目前，對引起沙田檸檬炭疽病的病原菌種類缺乏系統研究，而不同種類炭疽病對藥劑敏感性存在差異，明確其病原菌種類對于精準防控沙田檸檬炭疽病具有至關重要的作用。【擬解決的關鍵問題】為了研究引起廣州市沙田村沙田檸檬炭疽病的病原菌種類，2019—2021 年期間我們采集了具有炭疽病典型癥狀的沙田檸檬葉片和果實，開展病原菌的組織分離、致病性測定及其分子生物學鑒定，以期明確引起該地區檸檬炭疽病的病原菌種類，為沙田檸檬炭疽病的防治提供理論基礎和方向。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病樣：2019—2021 年期間采集自廣東省廣州市白云區沙田村沙田檸檬上具有炭疽病典型癥狀的葉片和果實；健康沙田檸檬植株的葉片和果實也采自沙田村。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、去離子水定容至1 000 mL。

試劑及儀器：植物DNA 提取試劑盒，愛思進生物技術（杭州）有限公司；PCR 擴增試劑盒2×EasyTaq PCR SuperMix（-dye），北京全式金生物技術有限公司。美國貝克曼Microfuge 20微量離心機（美國，Beckman Coulter,Inc.）、T100TMPCR 儀及美國伯樂1704487 小型水平電泳槽（美國，BIO-RAD company）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與形態特征觀察 每年選取具炭疽病癥狀的沙田檸檬葉15 片和有白斑的檸檬果實3 個，用剪刀在病健交界處剪出0.2 cm 左右的正方形小塊，依次用70%酒精浸泡30 s、2%NaClO 浸泡90 s、無菌水沖洗4 次，而后置于無菌濾紙上晾干，最后放置于PDA 培養基上于25 ℃培養箱中進行暗培養。3～5 d 后，通過挑取單孢子接種在新的PDA 平板上繼續進行純化培養。7～10 d 后，在顯微鏡下對分離出菌株的菌絲和孢子進行鏡檢，每個菌株觀察視野超過10 個，約能看到100 多個孢子，并統計其中50 個孢子的大小。

1.2.2 致病性測定 對僅從檸檬病果上分離獲得的真菌菌株命名為ST2，其代表菌株ST2-1、ST2-2 和ST2-3 采用針刺接種菌絲塊的方法分別接種3 個健康的沙田檸檬果實（每個果實上3 個接種點），以接種PDA 空白培養基作為陰性對照；同時在液體PD 培養基中對菌株ST3-1、ST3-2、ST3-3 以及ST4-1、ST4-2、ST4-3 進行培養，制成1×106CFU/mL 的孢子懸浮液，分別噴灑接種在3 株3 月齡的健康沙田檸檬苗的葉片和枝干上；以噴灑無菌水作為陰性對照。然后將這些檸檬果實和植株放置于溫度28 ℃、濕度75%的溫室中進行正常培養，光照/黑暗時間為12 h/12 h；每天對檸檬葉片和果實上的病害癥狀進行觀察，并拍照記錄。

1.2.3 真菌的分子生物學鑒定 將培養7 d的菌株ST2-1、ST2-2、ST2-3、ST3-1、ST3-2 和ST3-3以及ST4-1、ST4-2 和ST4-3 的菌絲分別從PDA平板上刮下來，迅速用液氮研磨。然后依據Axygen 動植物基因組DNA 制備試劑盒的說明書進行真菌全基因組DNA 的提取，研究中用到的引物合成及PCR 產物測序服務均購自上海生工生物工程有限公司。選取核糖體轉錄間隔區（ITS）、微管蛋白（β-Tubulin）、延伸因子1α 基因（EF-1α）、肌動蛋白Actin（ACT）、鈣調節蛋白（CAL）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、大亞基基因large subunit（LSU）genes 和幾丁質合成酶Chitin synthase（CHS1）的檢測引物為ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b、EF-2/EF-1、ACT-783R/ ACT-512F、CL1/CL2、gpd1/gpd2、LR5/LR0R 和CHS79-F/CHS354-R（表1），以提取的菌株全基因組DNA 為模板進行PCR 擴增［8-16］。PCR 反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，34 個循環；72 ℃延伸7 min；然后對PCR 產物進行電泳檢測，將陽性PCR 產物送去測序。在NCBI 的BLAST 中對獲得的片段信息進行對比并將部分基因片段提交到NCBI 數據庫，同時利用MegAlign 7.1.0（44）軟件以最大自然法分別建立ST2-1、ST3-1 和ST4-1 的進化樹，根據菌株之間的聚和程度確定病原菌的分類地位。

表1 本研究中用到的引物及其序列Table 1 The primer sequences used in this study

2 結果與分析

2.1 沙田檸檬炭疽病的危害及田間癥狀

沙田檸檬炭疽病可發生在檸檬的葉片、枝梢和果實上。炭疽病危害葉片時，初期多從葉尖或葉緣進行侵入，而后逐漸擴展成黃褐色云紋狀病斑，多呈“V”字型，嚴重時可造成大量落葉；炭疽病危害枝梢時多發生在梢頂，初為淡褐色橢圓形病斑，最后整個梢頂枯死；炭疽病危害果實時，最初為白色小點，在環境適宜時病斑逐漸擴大至整個果實，但這些白色片狀斑點不深入果皮，僅在果實表面造成危害，嚴重影響檸檬的外觀和經濟價值（圖1）。

圖1 沙田檸檬炭疽病的田間癥狀Fig.1 Symptoms of anthracnose disease on Shatian lemon in field

2.2 病原菌的培養特征及形態特征

通過對沙田檸檬炭疽病樣的組織分離和培養，共獲得30 株真菌菌株。經過單胞分離，在25 ℃培養箱中培養7 d 后，通過菌株的菌落顏色、菌落形態和菌絲孢子形態觀察，可將分離所得的30 株真菌菌株分為3 類。第一類僅從檸檬病果上分離獲得，命名為ST2，該類真菌的分離率為30%（該分離率僅指占在沙田檸檬上分離所得的炭疽菌屬Colletotrichumsp.真菌中的比例）；ST2菌落圓形，淡灰色，菌絲濃密，從平板背面可看到菌落上附有大量黑色孢子堆；菌絲無色，有分隔和分叉；孢子單胞、透明，梭形，兩端鈍圓，大小為14.0～19.8 μm × 4.4～6.1 μm（n=50）（圖2A～圖2C）。選取其中3 株（ST2-1、ST2-2、ST2-3）作為代表菌株進行后續研究。第二類僅從檸檬病葉上分離獲得，命名為ST3，該類真菌的分離率為10%；ST3 在PDA 培養基上的菌落邊緣均整齊，最初為白色，而后逐漸變為灰褐色，菌絲稀疏至濃密，無或少剛毛，菌落上附有黑色分生孢子粘孢團；菌絲為白色或棕褐色，有間隔和分支，孢子為卵圓形或圓柱形，透明，無分隔，內含1～3 個油球，大小為14.8～26.3 μm × 3.1～4.5 μm（n=50）（圖2D～圖2F）。選取其中3 株（ST3-1、ST3-2、ST3-3）作為代表菌株進行后續研究。第三類命名為ST4，該類真菌僅從檸檬病葉上分離獲得、分離率為60%，在PDA 培養基上的菌落邊緣均整齊，最初為白色，之后僅菌落中間變為淺灰色和白色相間，菌絲稀疏，無或少剛毛，菌落上附有橘紅色和黑色分生孢子粘孢團；菌絲為透明、有分枝和分隔，分生孢子單胞、橢圓形、透明且無隔膜，兩端圓形，內含1 個油球，大小為14.5～18.9 μm × 3.7～5.9 μm（n=50）（圖2G～圖2I）。從中選取3 株（ST4-1、ST4-2、ST4-3）作為代表菌株進行后續研究。由于每類真菌的生物學特性幾乎一致，因此文中僅顯示ST2-1、ST3-1 和ST4-1 在PDA 平板上的菌落形態及在顯微鏡下的孢子和菌絲形態（圖2）。

圖2 炭疽病菌屬病原菌ST2-1、ST3-1 和ST4-1 在PDA 培養基上培養7 d 后的菌落形態和分生孢子形態Fig.2 Colonial and conidial morphology characteristics of Colletotrichum sp.strains ST2-1,ST3-1 and ST4-1 cultured on PDA for 7 days

2.3 病原菌的致病性及分子鑒定

在健康的沙田檸檬果實上分別針刺接種菌株ST2（ST2-1、ST2-2 和ST2-3）的菌絲塊，PDA空白培養基作為陰性對照接種于檸檬果實上；將ST3（ST3-1、ST3-2、ST3-3）和ST4（ST4-1、ST4-2、ST4-3）濃度為1×106CFU/mL 的孢子懸浮液分別噴灑于3 月齡的健康檸檬葉片上（整株噴灑），無菌水作為陰性對照。7 d 后，接種的檸檬果實和葉片均出現與田間相似的炭疽病癥狀；而后從發病的沙田檸檬果實和葉片上可再分離獲得單一的、與原接種菌株的培養性狀和形態特征相一致的病原菌，從而進一步確定菌株ST2（ST2-1、ST2-2 和ST2-3）、ST3（ST3-1、ST3-2 和ST3-3）以及ST4（ST4-1、ST4-2 和ST4-3）均為沙田檸檬炭疽病的病原菌，圖3 中僅顯示ST2-1、ST3-1及ST4-1的致病性測定結果，其他菌株的接種結果與此相類似。

圖3 沙田檸檬炭疽病菌的致病力Fig.3 Pathogenicity of the pathogen causing anthracnose on Shatian lemon

為了對病原菌ST2、ST3 和ST4 進行分子生物學鑒定，本研究采用引物ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b、ACT-512F/ACT-783R、CL1C/CL2C 和CHS79-F/CHS354-R，以ST2（ST2-1、ST2-2 和ST2-3）全基因組為模板進行PCR 擴增，分別得到540、749、241、265 bp 的ITS、CAL、ACT和CHS1；以ST3（ST3-1、ST3-2 和ST3-3）全基因組為模板進行PCR 擴增，分別得到549、464、233、278 bp 的ITS、TUB2、ACT和CHS1片 段（圖4）。通過膠回收和測序比對后發現，分別以ST2-1、ST2-2 和ST2-3 為模板擴增的同一基因片段相似性達到100%，而以ST3-1、ST3-2和ST3-3 為模板擴增的同一基因片段相似性達到99%以上。將得到的序列在GenBank 中進行BLAST 比對，發現菌株ST2（ITS：OM 698365；ACT：OM 746167；CAL：OM 746165；CHS1：OM746166，此處的基因序列登陸號是以ST2-1為模板擴增獲得的片段信息）與暹羅刺盤孢C.siamenseMSO（ITS：MK673873.1；ACT：MK674786；CAL：MK674788；CHS1：MK674790）具有99% 以上的同源性；而ST3（ITS：MZ 646051；ACT：OK 086976；TUB：OK 086977；CHS1：OK086977，此處的基因序列登陸號是以ST3-1 為模板擴增獲得的片段信息）則與蘭花刺盤孢C.cliviicolaLJ2-1（ITS：MT 351121；CHS1：MT 396799；TUB：MT 396863；ACT：MT396767）具有較高的同源性，達到99%以上。同時我們也以LR5/LR0R 和EF-2/ EF-1 為引物，對ST3 基因組進行分子鑒定，擴增獲得904 bp 的LSU和568 bp 的TEF1基因，通過NCBI BLAST 發現ST3 也屬于Colletotrichumsp.（LSU：DQ286216.1，TEF1：GU994315.1）。但由于這2 個基因在炭疽菌屬內小種的分類研究中應用較少且鑒定效果不穩定，因此在后續建立進化樹時未予采用［17］。綜上所述，初步判斷ST2 屬于暹羅刺盤孢（C.siamense），ST3 屬于蘭花刺盤孢菌（C.cliviicola）。

同時，選用ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b、EF-2/EF-1、LR5/LR0R、gpd1/gpd2 和CHS79-F/ CHS354-R為引物，以ST4（ST4-1、ST4-2 和ST4-3）全基因組為模板進行PCR 擴增，分別獲得552、443、565、903、638、299 bp 的ITS、TUB2、TEF1、LSU、GAPDH、CHS1序列片段（圖4）；經過測序和在NCBI BLAST 后發現，ST4（ITS：MZ645939）與果生刺盤孢菌（C.fructicola）MSCJ06 的同源性最高，初步確定ST4 屬于果生刺盤孢菌（C.fructicola）。

圖4 ITS 及其他相關基因的PCR 擴增產物電泳圖譜Fig.4 Electrophoregram of the PCR product of ITS and other related genes

2.4 病原菌ST2 的進化樹建立

在對ST2-1、ST2-2 和ST2-3 進行分子生物學鑒定時發現，同一個基因在3 個菌株中擴增得到序列相似性均達到99%以上。因此，我們僅上傳基于ST2-1 獲得的ITS（OM698365）、ACT（OM746167）、CHS1（OM746166）和CAL（OM746165）序列。然后基于ACT和CHS1基因序列并采用最大自然法構建ST2-1 的系統發育樹，結果（表2、圖5）表明：ST2-1 與暹羅刺盤孢菌（C.siamense）的遺傳距離最近，聚為一類；與隱秘刺盤孢（C.aenigma）和山茶刺盤孢（C.camelliae）的遺傳距離最遠。結合形態學特征及分子鑒定結果，確定引起沙田檸檬炭疽病的病原菌ST2-1 為暹羅刺盤孢菌（C.siamense）。

圖5 基于ACT 和CHS1 序列以最大自然法建立ST2-1 和ST3-1 及其近緣屬種的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of the ST2-1,ST3-1 and their relative strains based on ACT and CHS1 sequences with the maximum natural method

表2 供試參考炭疽菌菌株及其GenBank 登錄號Table 2 Reference isolates of Colletotrichum used in this study and their GenBank accession No.

2.5 病原菌ST3 的進化樹建立

在 對ST3-1、ST3-2 和ST3-3 進行分子生物學鑒定時發現，同一個基因在3 個菌株中擴增得到序列相似性均達到100%。因此，我們僅上傳基于ST3-1 獲得的ITS（MZ646051）、ACT（OK086976）、CHS1（OK086977）和TUB（OK086977）序列。然后基于ACT和CHS1序列并采用最大自然法構建ST3-1 的系統發育樹，結果表明：ST3-1 與蘭花刺盤孢（C.cliviicola）的遺傳距離最近，聚為一類；與果生刺盤孢菌（C.fructicola）和暹羅刺盤孢菌（C.siamense）的遺傳距離最遠。結合形態學特征及分子鑒定結果，確定引起沙田檸檬炭疽病的病原菌ST3-1 為蘭花刺盤孢菌（C.cliviicola）（表2、圖5）。

2.6 病原菌ST4 的進化樹建立

在對ST4-1、ST4-2 和ST4-3 進行分子生物學鑒定時發現，同一個基因在3 個菌株中擴增得到序列相似性均達到99%。因此我們僅上傳基于ST4-1 獲得的ITS（MZ645939）、LSU（OK638977）、CHS1（OK667073）、GAPDH（OK667072）和TUB2（OK667071）序列。然后基于GAPDH和CHS1序列并采用最大自然法構建ST4-1 的系統發育樹，結果（圖6）表明：ST4-1 與果生刺盤孢菌（C.fructicola）的遺傳距離最近，聚為一類；與喀斯特炭疽菌（C.karsti）的遺傳距離最遠。結合形態學特征及分子鑒定結果，確定引起沙田檸檬炭疽病的病原菌ST4-1 為果生刺盤孢菌（C.fructicola）。

圖6 基于GAPDH 和CHS1 序列以最大自然法建立ST4-1 及其近緣屬種的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of the ST4-1 and its relative strains based on GAPDH and CHS1 sequences with the maximum natural method

3 討論

炭疽病在柑橘類水果的生長期和采后期均能夠造成嚴重的經濟損失。研究表明，引起廣東省各柑橘產地炭疽病的病原菌主要為盤長孢狀刺盤 孢（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）。2007 年，盤長孢狀刺盤孢曾在廣東省德慶官圩鎮和馬圩鎮貢柑上引起大面積的炭疽病，僅當年的果園損失就高達2 000 多萬元［18］；而后關于不同炭疽菌小種引起炭疽病的研究也逐漸有報道，如暹羅刺盤孢菌（C.siamense）和毛豆炭疽病菌（C.truncatum）能夠分別在肇慶十月桔和龍門市年橘上引起柑橘炭疽病［19-20］。目前在廣東還沒有果生刺盤孢菌（C.fructicola）在柑橘上引起病害的報道，而果生刺盤孢菌能夠在湖南常德石門甜橙上引起炭疽病。與盤長孢狀刺盤孢相似，該病原菌侵染柑橘果實，最初可在果實上造成小而褐色的病斑，隨后病斑會發展為各種形狀的大病斑，最后造成果實腐爛和脫落［4］。

本文從發病檸檬果實上分離得到的暹羅刺盤孢菌引起的病癥與以往報道的炭疽病在柑橘類果實上引起的病癥截然不同，僅為白色片狀斑點不深入果皮；該病害僅影響沙田檸檬果實的外觀，不透過果皮，對檸檬的品質沒有明顯影響；但在室內接種試驗中發現，暹羅刺盤孢菌僅可通過傷口在果實上產生危害，由此推斷該病害的侵入有可能與物理傷口或昆蟲的危害有關；對該類病原菌引起的炭疽病的防治應結合控蟲，從而達到最優的防治效果。而果生刺盤孢菌能夠在柑橘上引起病害，為廣東省首次報道。在我國，除柑橘外，果生刺盤孢菌還可對核桃、櫻桃、蛋黃果等的果實和葉片造成危害［21-23］。此外，有研究表明，蘭花刺盤孢僅可在我國的煙草和雜交狼尾草上引起葉斑病和炭疽病［24-27］，而本研究發現蘭花刺盤孢能夠在沙田檸檬上引起炭疽病為國際上首次報道。目前對于炭疽病的防控，主要采用生物防治和化學防治的方法，不同小種對同一種藥劑的敏感性也不同［28-29］。因此，明確引起炭疽病的炭疽菌種類對該病的防治至關重要。

4 結論

對沙田檸檬炭疽病病原菌的研究發現，引起該病害的病原菌為果生刺盤孢菌（C.fructicola）、暹羅刺盤孢菌（C.siamense）和蘭花刺盤孢（C.cliviicola）。通過致病性測定發現，果生刺盤孢菌和蘭花刺盤孢均能夠在沙田檸檬葉片上引起炭疽病，而暹羅刺盤孢菌則可以在檸檬的果實和葉片上引起病害；但從田間沙田檸檬病葉片上僅能夠分離獲得果生刺盤孢菌和蘭花刺盤孢，而果實上也僅能夠獲得暹羅刺盤孢菌。通過對3 個不同炭疽屬病原菌的分子生物學鑒定和進化樹建立表明，除ITS 外，鈣調蛋白（CAL）、肌動蛋白（ACT）和幾丁質合成酶（CHS1）可以穩定應用于炭疽菌屬真菌不同小種之間的鑒定。在對沙田檸檬炭疽病的防治上，要科學用藥，兼顧到不同的病原菌。但是關于果生刺盤孢菌、暹羅刺盤孢菌和蘭花刺盤孢菌在沙田檸檬上的致病機理及侵染途徑仍需進一步深入研究。