乙酰丙酮分光光度法測定蔬菜甲醛含量及風險評估

蘭珊珊，魏茂瓊，林 昕，沙凌杰，李紅菊，劉宏程

（1.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所/農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（昆明），云南 昆明 650205；2.祥云縣農業科學技術推廣所，云南 祥云 672100）

【研究意義】甲醛，無色，有刺激性氣味，易溶于水，其水溶液具有防腐殺菌性能［1-2］。甲醛毒性來源于醛的親電性，在此過程中，副產物的形成會損害DNA、RNA、蛋白質和脂質等生物大分子的活性，從而抑制細胞正常生理功能［3-4］。急性暴露于甲醛會刺激五官和皮膚黏膜，導致炎癥反應，上呼吸道疾病增加，呼吸短促和喘息等［5-6］。長期接觸甲醛對人體神經系統、肺、肝臟、免疫系統及生殖細胞均有損害［7-9］，可導致基因突變和癌癥的發生［10］?；诩兹┑膰乐匚：?，2006 年世界衛生組織下屬的國際癌癥研究局（IARC）正式公布甲醛是人類致癌物（A1類）［11］。在人國有毒化學物品控制名單中，甲醛居第二位［12］。《中華人民共和國食品安全法》已將其明確列為禁用添加劑，衛生部辦公廳關于GB 2760-2011《食品添加劑使用標準》有關問題的復函中也明確指出，甲醛不得作為食品用加工助劑生產經營和使用［13］。但近年來，在蔬菜運輸過程中噴灑甲醛溶液保鮮的新聞屢見不鮮［13］，同時蔬菜在貯運過程中使用的包裝材料也會造成甲醛溶出，對人體健康造成潛在威脅［14］。蔬菜中甲醛的殘留問題已成為人們密切關注的食品安全問題之一?！厩叭搜芯窟M展】有關植源性食品中甲醛含量檢測的方法標準主要有農業行業標準《NY/T 3292-2018 蔬菜中甲醛含量的測定 高效液相色譜法》《NY/T 1283-2007 香菇中甲醛含量的測定》，出入境檢驗檢疫行業標準《SN/T 1547-2011 進出口食品中甲醛的測定 液相色譜法》及地方標準《DB12/T 883-2019 食用菌中甲醛的測定高效液相色譜法》等。目前蔬菜中甲醛含量測定最常用的方法為高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法，分析檢測普遍采用的是農業行業標準NY/T 3292-2018，使用的也是HPLC 法。除HPLC 法外，植源性食品中甲醛檢測的方法還有乙酰丙酮法、酚試劑衍生法和催化光度法等［1,13,15-16］。【本研究切入點】HPLC 法存在檢測成本高、樣品前處理繁瑣、比色液不穩定等問題。蔬菜流通中人為不當使用而產生的外源性甲醛，是造成蔬菜中甲醛污染的主要原因，另外蔬菜在代謝過程中也會生成少量內源性甲醛［17］。本研究通過超聲提取蔬菜中的甲醛，對提取和分析條件進行優化，分析常見及甲醛殘留高關注度蔬菜中的甲醛殘留量，并利用數學模型結合膳食數據對甲醛的殘留風險進行評估。【擬解決的關鍵問題】建立適應基層實驗室應用的蔬菜中甲醛含量測定的快速方法，掌握常見及甲醛殘留高關注度蔬菜中甲醛含量的殘留情況，分析蔬菜中甲醛含量對人群的膳食暴露風險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蔬菜樣品取樣參照NY/T 789-2004《農藥殘留分析樣本的采樣方法》和NY/T 2103-2011《蔬菜抽樣技術規范》規定執行。抽樣品種包括大白菜、上海青、生菜、芹菜、菠菜、西蘭花、黃瓜、西葫蘆、豇豆、山藥、秋葵和蘆筍12 種常見蔬菜，樣品抽自云南昆明、曲靖、玉溪、紅河、臨滄、大理、楚雄等種植基地、農貿市場、蔬菜批發市場和商超等。每種蔬菜的樣品數不少于10 個，總計抽取383 個樣品，產地包括云南、海南、山東、湖南或湖北等。

乙酸銨、乙酰丙酮、氫氧化鈉、硫酸、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），冰乙酸（分析純，重慶川東化工有限公司），碘化鉀（分析純，成都市科隆化學用品有限公司），殼聚糖（分析純，上海泰坦化學有限公司），實驗用水由PURELAB flex 純水機系統制得（英國埃爾格ELGALab Water 公司）。溶液配制、甲醛標準貯備溶液的標定參照農業行業標準NY/T 1283-2007《香菇中甲醛含量的測定》。

SPECORD 210 Plus 型紫外分光光度計（德國Analytik Jena AG 公司），AE 100 電子分析天平（瑞士 Mettler Toledo 公司），KQ500-E 型超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），TGL-15B 高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），HWS26 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 確定最大吸收波長 將5 mL 甲醛標準溶液（10 μg/mL）加入25 mL 比色管中，加水定容至25 mL，加入2.5 mL 乙酰丙酮溶液，混勻后60 ℃水浴加熱15 min，冷卻后進行350～800 nm全波段掃描，測定最大吸收波長。

1.2.2 標準曲線繪制 依次吸取0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00 mL 10.0 μg/L的甲醛標準溶液于25 mL 具塞比色管中，加水至25 mL，加入2.5 mL 乙酰丙酮溶液，混勻后置于60 ℃水浴中15 min，冷卻至室溫，以空白液為參比，于波長413 nm處用1 cm比色皿測定吸光度值，繪制標準曲線。

1.2.3 測定條件優化 將大白菜樣品切成碎片（5 mm×5 mm 左右）后混勻，稱取10.0 g 于100 mL 離心管中（若樣品為深色蔬菜，可加入2.0 g 殼聚糖進行脫色［15］），加入純水至100 mL，分別超 聲提取10、15、20、25、30、35、40 min，5 000 r/min 離心5 min。吸取10 mL 上清液于25 mL 具塞比色皿中，加水至25 mL，加入2.5 mL 乙酰丙酮溶液，混勻后置于60 ℃水浴中15 min，冷卻至室溫，立即以空白液為參比，于波長413 nm 處用1 cm 比色皿進行比色，記錄吸光度值，重復6 次。

將2.5 mL 甲醛標準溶液（10 μg/mL）加入25 mL 比色管中，加水定容至25 mL，研究顯色劑添加量、水浴溫度、水浴時間對測定結果的影響，顯色劑添加量為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL；水浴溫度為50、60、70、80、90、100 ℃；水浴時間為5、10、15、20、25、30 min，進行單因素實驗，進行測定條件優化，6 次重復。

1.2.4 樣品測定 將蔬菜樣品可食部分切成碎片（5 mm×5 mm 左右）后混勻，稱取10.0 g 樣品于100 mL 離心管中（深色蔬菜中加入2.0 g 殼聚糖），加入純水至100 mL，加塞超聲提取20 min，5 000 r/min 離心5 min。準確吸取10 mL 樣品上清液于25 mL 具塞比色皿中，加水至25 mL，加入2.5 mL 乙酰丙酮溶液，混勻后置于60 ℃水浴中15 min，冷卻至室溫，立即以空白液為參比，于波長413 nm 處用1 cm 比色皿進行比色，記錄吸光度值。每個樣品平行測定兩次，取平均值。

1.2.5 回收率和精密度試驗 選擇大白菜、上海青、黃瓜、豇豆、山藥5 種蔬菜，切碎混勻后按1.5、7.5、15 mg/kg 的水平添加甲醛，按照1.2.4的方法測定甲醛含量，6 次重復。

1.2.6 暴露評估 采用點評估方法，根據蔬菜中甲醛每日膳食暴露水平（mg/kg bw）=蔬菜日消費重量（kg/kg bw）×蔬菜中甲醛殘留量（mg/kg）［18-19］，用公式（1）計算。急性膳食暴露是指一次性或短期內大量攝入某種危害物，用公式（2）計算；慢性膳食暴露風險評估是估算人們在長時間可能的暴露程度（范圍），用公式（3）計算。

式（1）中，y為個體通過蔬菜攝入甲醛的每日暴露量，x為蔬菜的每日消費量（g），c為蔬菜甲醛的含量（平均值或最高值，mg/kg），w為個體平均體重（kg），蔬菜整體消費量參照中國營養學會推薦的不同個體人群每日蔬菜攝入量［20-22］，每種蔬菜的消費量參照WHO 給出的可涵蓋97.5%食用者每天消耗的該類食品的量［23］，個體平均體重按 58.2 kg 計［24］，不同年齡段個體平均體重依據金水高［25］編寫的《中國居民營養與健康狀況調查報告之十》。

式（2）、（3）中，MOS為安全限值，aPAD為甲醛急性人群校正劑量，其中美國環境保護局研究確定甲醛急性參考劑量（ARfD）為15 mg/kg bw，而國際上通常再除以一個安全系數10，從而得出甲醛的aPAD為1.5 mg/kg bw［19］。ADI為甲醛每日允許攝入量，美國國家環境保護局（EPA）建議甲醛的ADI值為 0.2 mg/kg bw［26］。一般地，如果MOS＞1，暴露水平為“安全”，通常認為該危害物對人體的健康風險是可接受的；而如果MOS≤1，則認為該危害物對人體的健康風險超過可接受限值，應采取適當的風險管控措施，MOS越大，風險越小，MOS越小，風險越大［18］。

1.3.7 數據處理 應用 Microsoft Excel 2021 處理原始數據與作圖，采用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長

甲醛標準溶液與乙酰丙酮溶液加熱反應，反應液冷卻后進行350～800 nm 全波段掃描，測定最大吸收波長，結果如圖1 所示，最大吸收波長為413 nm。

圖1 甲醛與乙酰丙酮反應液的最大吸收波長Fig.1 Maximum absorption wavelength of reaction solution of formaldehyde and acetylacetone

2.2 標準曲線和方法檢出限

如圖2 所示，甲醛濃度在5～80 μg/25 mL，即0.2～3.2 mg/kg 范圍內與吸光度值呈良好線性關系，回歸方程為y=0.0205x+0.0259，相關系數r=0.9996，檢出限為0.45 mg/kg，定量限為1.5 mg/kg。

圖2 甲醛測定的標準曲線Fig.2 Standard curve for determination of formaldehyde

2.3 單因素條件的確定

用超聲水提蔬菜中的甲醛，結果如圖3 所示。當超聲提取20 min 時，甲醛含量最高，隨著超聲提取時間的延長，甲醛含量逐漸降低，因此將前處理試樣制備的超聲提取時間確定為20 min。

圖3 超聲提取時間對甲醛含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on determination of formaldehyde content

在甲醛標準溶液中加入不同體積的乙酰丙酮溶液，確定顯色反應液乙酰丙酮的用量。結果如圖4 所示，當乙酰丙酮溶液的體積小于2.0 mL 時，吸光度值偏小，這是由于顯色劑用量過少，反應不完全；當乙酰丙酮溶液的體積在2.0～3.0 mL 時，吸光度值保持基本不變，說明此時已基本反應完全；當乙酰丙酮溶液的體積大于3.0 mL，吸光度值減小。因此確定顯色劑乙酰丙酮溶液的用量為2.5 mL。

圖4 乙酰丙酮用量對吸光值的影響Fig.4 Effect of acetylacetone consumption on the absorbance value

在甲醛標準溶液中加入2.5 mL 乙酰丙酮溶液，混勻后分別于50、60、70、80、90、100 ℃下水浴加熱15 min，結果（圖5）表明，當水浴加熱溫度為60 ℃時反應的吸光度值最大。當水浴溫度在70～100 ℃時，隨著溫度升高，吸光值逐漸下降，說明溫度過高會破壞反應液的穩定性，影響顯色反應，因此將水浴加熱的溫度確定為60 ℃。而將甲醛溶液與乙酰丙酮溶液的反應液在60 ℃水浴中分別加熱，結果（圖6）顯示，當水浴時間在5～10 min 之間時，吸光度值較低；當水浴時間為15 min 時，吸光度值最大；當水浴時間長于15 min 后，吸光度值隨水浴時間的延長而逐漸降低，說明水浴時間過長會破壞反應液的穩定性，影響顯色反應，因此將水浴加熱的時間確定為15 min。

圖5 水浴溫度對吸光值的影響Fig.5 Effect of water bath temperature on the absorbance value

圖6 水浴時間對吸光值的影響Fig.6 Effect of water bath time on the absorbance value

2.4 回收率和精密度

以定量限的1 倍、5 倍和10 倍作為添加量進行加標回收實驗，每種添加水平重復測定6 次，計算平均回收率，并求得相對標準偏差，結果如表1 所示。當樣品中甲醛的添加水平為1.5 mg/kg時，回收率為87.23%～92.40%，相對標準偏差為2.23%～4.21%；當添加水平為7.5 mg/kg 時，回收率為86.33%～92.12%，相對標準偏差為2.83%～3.61%；添加水平為15.0 mg/kg 時，回收率在86.38%～91.60%之間，相對標準偏差為2.41%～3.59%。在3 種添加水平下，甲醛在不同蔬菜中的平均回收率為86.33%～ 92.40%，相對標準偏差在2.23%～4.21%，準確度和精密度均滿足甲醛含量分析的要求。

表1 不同蔬菜樣品中甲醛添加回收率和精密度Table 1 Added recovery rate and precision of formaldehyde in different vegetable samples

2.5 主要蔬菜產品中甲醛含量

用上述方法對12 個蔬菜品種、383 個蔬菜樣品中的甲醛含量進行測定，所有蔬菜種類均有未檢出樣品，在計算平均值和中位值時，所有未檢出樣品中甲醛含量均按檢出限0.45 mg/kg計算。結果（表2）顯示，蔬菜中甲醛的檢出率為26.37%，不同蔬菜的檢出率在5.00%～72.73%之間，檢出值為ND 8.01 mg/kg，檢出平均值為0.47～1.67 mg/kg，其中黃瓜的最高、蘆筍的最低，大白菜的最大、西葫蘆的最小；大白菜、黃瓜和山藥3 種蔬菜中甲醛的檢出率相對較高，均在40%以上。

表2 12 種蔬菜中甲醛含量和檢出率Table 2 Contents and detection rates of formaldehyde in 12 varieties of vegetables

2.6 膳食暴露評估

用點評估的方法分析不同蔬菜中甲醛含量的膳食暴露水平及風險。計算急性膳食暴露水平采用每種蔬菜中甲醛檢出的最大值，計算慢性暴露水平采用每種蔬菜甲醛檢出的平均值。每種蔬菜的消費量參照GEMS/FOOD 全球環境監測規劃/食品污染監測與評估規劃的消費量數據庫，以各成員國調查結果的P97.5 為基礎統計獲得；該數據庫中未統計山藥的日攝入量，故山藥的日攝入量用中國營養學會推薦的人群每日蔬菜攝入量最大值500 g［20］除以人群平均體重58.2 kg［24］獲得。結果如表3 所示，各種蔬菜中甲醛含量的急性膳食暴露量為0.0052～0.068 mg/kg (bw/d)，慢性暴露水平為0.0019～0.014 mg/kg (bw/d)，其中大白菜的暴露水平最高，急性暴露MOS為22.0，慢性暴露MOS為14.1，秋葵的暴露水平最低，急性暴露和慢性暴露MOS分別為289.8、106.2。雖然不同蔬菜中甲醛含量的膳食暴露水平差異較大，但無論是急性還是慢性暴露水平均較低，MOS值均遠大于1，說明不同蔬菜中甲醛的暴露風險水平均很低。

表3 不同蔬菜中甲醛膳食暴露水平和暴露風險Table 3 Dietary exposure level and exposure risk of formaldehyde in different vegetables

依據中國營養學會推薦的學齡前兒童、學齡兒童和普通人群等不同個體人群每日蔬菜攝入量，計算蔬菜中甲醛含量的膳食暴露量和評估膳食風險。本著最大風險原則，本文在計算蔬菜中甲醛暴露水平時均采用各年齡人群推薦蔬菜消費量的最大值，計算急性膳食暴露水平采用所有蔬菜中甲醛檢出的最大值（8.01 mg/kg），計算慢性暴露水平采用所有蔬菜甲醛檢出的平均值（0.78 mg/kg）。結果表明，甲醛在蔬菜中的殘留對我國不同人群的急性膳食暴露水平為0.062～0.15 mg/kg (bw/d)，MOS為10.1～24.3；慢性暴露水平在0.0060～0.014〔mg/kg (bw/d)〕，MOS在13.8～33.3。不同年齡不同性別人群的暴露水平和暴露風險有差異，整體來說未成年人（＜18 歲）蔬菜中甲醛含量的膳食暴露風險大于成年人和老年人，其中4～6 歲年齡段的暴露風險最大，但MOS值均大于1，表明急性暴露和慢性暴露風險均在可接受范圍內，各類人群暴露水平和暴露風險詳見表4。

表4 蔬菜中甲醛含量對各類人群的膳食暴露水平和暴露風險Table 4 Dietary exposure level and exposure risk of formaldehyde contents in vegetables for different populations

3 討論

目前蔬菜中甲醛含量測定的常用標準是農業行業標準NY/T 3292-2018《蔬菜中甲醛含量的測定高效液相色譜法》，用高效液相色譜測定蔬菜中的甲醛含量，方法定量限為2.0 mg/kg，HPLC 法能夠消除樣品基體對檢測帶來的影響，但存在檢測成本高、樣品前處理繁瑣、反應時間長、比色液不穩定等問題。而傳統的乙酰丙酮分光光度法采樣蒸餾的方式提取甲醛，不僅操作繁瑣耗時長，提取率也較低。本方法采用超聲提取，優化各實驗條件后，定量限為1.5 mg/kg，回收率在86.33%～92.40%之間，滿足蔬菜中甲醛含量測定的要求，且操作簡便，可作為蔬菜中甲醛含量測定的快速檢測方法。用上述方法分析的12 個蔬菜品種、383 個蔬菜樣品中，甲醛檢出率為26.37%，檢出值在ND～8.01 mg/kg 之間，與近年來國內的相關分析結論基本一致［1,12-13,15］。但WHO 曾有報告公布蔬菜和水果中甲醛含量為3.3～17.3 mg/kg［27］，與我們的結果有一定差異，可能與樣本來源、樣本品種、成熟度、樣本量、測定方法及貯藏時間等因素有關。

在食品危害因子的風險評估研究中，點評估的方法操作簡單，已被用于食用菌、水產品等中甲醛的暴露評估，但該法未考慮污染物含量和消費量的變異性以及抽樣的不確定性，易高估暴露量，使評估結果過于保守［28-29］。本著最大風險原則，本研究在評估時，甲醛含量和蔬菜消費量均是取高值進行分析，是基于極保守假設的暴露估計，評估結果遠高于實際暴露水平，但這種極端保守的評估結果仍顯示蔬菜中甲醛含量的膳食暴露風險較低，MOS值最小的都為10.1，是安全限值1 的10 倍，說明蔬菜中甲醛殘留量的膳食攝入風險水平較低。但由于各類農產品中均可能含有少量內源性甲醛［27］，消費者在實際膳食攝入過程中，甲醛的暴露途徑并不是單一的，僅對蔬菜產品中的甲醛殘留量進行評估并不足以全面描述甲醛的膳食攝入暴露風險。另一方面，部分評估參數還不夠全面，目前我國基礎膳食數據統計尚不完全。本研究中各種蔬菜的日攝入量是參照GEMS/Food 提供的大份餐數據，但東西方飲食習慣有一定差異，以及特殊人群的消費習慣等數據也還較為缺乏，因此現有的評估結果存在一定的局限性，還需要不斷完善暴露評估的各項基礎數據。

4 結論

本試驗通過超聲提取，研究了提取時間、顯色劑用量、水浴溫度和時間對甲醛含量測定的影響，建立了蔬菜中甲醛測定的乙酰丙酮分光光度法，方法精確度和靈敏度符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》的要求，能夠滿足蔬菜中甲醛測定的需求，適應于蔬菜中甲醛的快速測定和基礎實驗室應用；對12 個蔬菜品種的383 個樣品中的甲醛含量進行分析發現，不同蔬菜中甲醛的檢出率為5.00%～72.73%，總檢出率為26.37%，不同蔬菜的檢出平均值在0.47～1.67 mg/kg；不同蔬菜中甲醛含量對一般人群的膳食暴露水平為0.0019～0.068 mg/kg (bw/d)，MOS為 14.1～289.8，蔬菜中甲醛含量對不同人群的膳食暴露水平為0.0060～ 0.15 mg/kg (bw/d)，MOS在10.1～33.3，所有評估的MOS均大于1，不同蔬菜中的甲醛膳食攝入水平和風險以及蔬菜中甲醛殘留對我國不同人群的攝入風險都有差異，但整體來說，基于現有的風險評估模型和膳食數據的評估結果，蔬菜中甲醛殘留量的膳食攝入風險較低，在可接受范圍內。