知母栽培品和野生品的指紋圖譜建立及差異性成分確認(rèn)

常鑫鑫 李倩 薛紫鯨 景松松 趙艷云 鄭玉光 宋軍娜

中圖分類號(hào) R282 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）02-0146-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.02.04

摘 要 目的 建立知母栽培品和野生品的指紋圖譜，確認(rèn)兩者的差異性成分。方法 采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，以高效液相色譜法結(jié)合《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》建立14批知母栽培品和14批知母野生品的指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，通過(guò)與混合對(duì)照品色譜圖比對(duì)指認(rèn)共有峰。同法測(cè)定知母栽培品和野生品中指認(rèn)共有峰對(duì)應(yīng)成分的含量，通過(guò)主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析確認(rèn)兩者的差異性成分，并比較其含量。結(jié)果 在28批知母藥材中共有10個(gè)共有峰，指認(rèn)出新芒果苷（峰1）、芒果苷（峰2）、異芒果苷（峰3）、知母皂苷BⅡ（峰7）、知母皂苷BⅢ（峰8）、知母皂苷Ⅰ（峰9）、知母皂苷AⅢ（峰10）7個(gè)成分;各樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均不低于0.963。知母栽培品與野生品中7個(gè)成分的平均總含量分別為74.18、84.72 mg/g，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。知母栽培品與野生品可被分為兩類，差異性成分為新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ（變量投影重要性值均大于1）。知母栽培品中新芒果苷含量明顯高于野生品（P<0.05），芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ含量均明顯低于野生品（P<0.05）。結(jié)論 成功建立了知母的指紋圖譜，并初步確認(rèn)了知母栽培品和野生品的差異性成分。

關(guān)鍵詞 知母;野生品;栽培品;指紋圖譜;多成分定量分析;差異性成分

Establishment of fingerprints and differential component identification of cultivated and wild Anemarrhena asphodeloides

CHANG Xinxin1，LI Qian1，XUE Zijing1，JING Songsong1，ZHAO Yanyun1，ZHENG Yuguang2，SONG Junna1（1. College of Pharmacy， Hebei University of Chinese Medicine/Hebei Traditional Chinese Medicine Processing Technology Innovation Center， Shijiazhuang 050200， China; 2. Hebei Chemical and Pharmaceutical College， Shijiazhuang 050200， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To establish the fingerprints of cultivated and wild Anemarrhena asphodeloides， and to identify their differential components. METHODS Using an evaporative light-scattering detector， ?the high performance liquid chromatography combined with Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition） were used to establish fingerprints of 14 batches of cultivated A. asphodeloides and 14 batches of wild medicinal materials， and evaluate their similarity. The common peaks were identified by comparison with the chromatogram of the mixed control. At the same time， the contents of components corresponding to common peaks in cultivated and wild A. asphodeloides were determined. The principal component analysis and orthogonal partial least squares discrimination analysis were adopted to identify differential components of them， and compare the contents of them. RESULTS Among 28 batches of A. asphodeloides， 10 common peaks were found， i.e. neomangiferin （peak 1）， mangiferin （peak 2）， isomangiferin （peak 3）， timosaponin BⅡ （peak 7）， timosaponin BⅢ （peak 8）， timosaponin Ⅰ （peak 9）， timosaponin AⅢ （peak 10）. The similarities of fingerprints of samples with control fingerprint were no less than 0.963. The average total contents of seven components in cultivated and wild A. asphodeloides were 74.18 and 84.72 mg/g， respectively; there was statistical significance （P<0.05）. The cultivated and wild A. asphodeloides could be divided into two categories. The differential components were neomangiferin， mangiferin， timosaponin BⅡ and timosaponin AⅢ （VIP values were all higher than 1）. The content of neomangiferin in cultivated products was significantly higher than that in wild products （P<0.05）， and the contents of mangiferin， timosaponin BⅡ and timosaponin AⅢ were significantly lower than those in wild products （P<0.05）. CONCLUSIONS Fingerprint of A. asphodeloides is established， and differential components of cultivated and wild A. asphodeloides are identified primarily.

KEYWORDS ? Anemarrhenae asphodeloides; wild product; cultivated product; fingerprints; multi-component quantitative analysis; differential components

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，味苦、甘，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥的作用，常用于中醫(yī)臨床治療外感發(fā)熱、內(nèi)傷發(fā)熱等熱癥[1-2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，知母的主要化學(xué)成分包括雙苯吡酮類、甾體皂苷類、多糖類、木脂素類等[3]，具有治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、抑郁癥等作用[4-6]。

根據(jù)繁殖生長(zhǎng)方式的不同，知母分為栽培品和野生品兩種類型，主要分布于我國(guó)河北、山西、內(nèi)蒙古、陜西、吉林、河南、山東等地[7]。2020年版《中國(guó)藥典》（一部）以芒果苷和知母皂苷BⅡ兩個(gè)成分作為知母質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[1]，但并不能全面地反映知母藥材的整體質(zhì)量，也不能體現(xiàn)知母栽培品與野生品的差異。

本研究采用高效液相色譜法對(duì)知母栽培品和野生品進(jìn)行化學(xué)成分分析，建立知母栽培品和野生品的指紋圖譜;同時(shí)在此基礎(chǔ)上，建立知母中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ共7個(gè)化學(xué)成分的含量測(cè)定方法，通過(guò)多成分含量測(cè)定和化學(xué)模式識(shí)別分析，比較知母栽培品與野生品的化學(xué)成分差異，以期為尋求更優(yōu)質(zhì)的知母資源提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260型高效液相色譜儀及其配套的G4260B型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、G7111A型四元梯度泵、G7129A型自動(dòng)進(jìn)樣器、OpenLab CDS2.3色譜工作站（美國(guó)Agilent公司），JP-060S型超聲波清洗儀（深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司），ME204E型十萬(wàn)分之一電子天平、BSA224S-CW型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司），Milli-Q型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

新芒果苷對(duì)照品（批號(hào)19072315，純度≥98%）、芒果苷對(duì)照品（批號(hào)19040123，純度≥98%）、異芒果苷對(duì)照品（批號(hào)19072905，純度≥98%）、知母皂苷BⅡ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)19052605，純度≥98%）、知母皂苷BⅢ對(duì)照品（批號(hào)20052209，純度≥96%）、知母皂苷Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)20052405，純度≥98%）、知母皂苷AⅢ對(duì)照品（批號(hào)19040108，純度≥98%）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

知母藥材共28批（編號(hào)Z1～Z14、Y1～Y14），其中Z1～Z14為知母栽培品、Y1～Y14為知母野生品，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)所/孫寶惠全國(guó)名老中醫(yī)藥傳承工作室孫寶惠教授鑒定，均為百合科植物知母A. asphodeloides Bge.的干燥根莖。藥材樣品保存于河北中醫(yī)學(xué)院中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心。28批知母藥材的來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，5%A→7%A;5～12 min，7%A→15%A;12～20 min，15%A→20%A;20～23 min，20%A→23%A;23～36 min，23%A;36～40 min，23%A→29%A;40～43 min，29%A→35%A;43～51 min，35%A→46%A;51～60 min，46%A→95%A）;流速為1.0 mL/min;柱溫為20 ℃;漂移管溫度為70 ℃;霧化溫度為90 ℃;載氣流速為1.6 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ對(duì)照品適量，置于同一5 mL量瓶中，加70%乙醇溶解、定容，制成上述成分質(zhì)量濃度依次為0.428、0.395、0.023、0.583、0.073、0.063、0.104 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取知母栽培品或野生品藥材粉末（粉碎，過(guò)60目篩，下同）0.50 g，置于具塞錐形瓶中，按照料液比1 ∶ 40（g/mL）精密加入70%乙醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取30 min，室溫冷卻，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心（轉(zhuǎn)速13 000 r/min，時(shí)間10 min）兩次，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4 知母藥材指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取知母藥材粉末（編號(hào)Z1）適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，記錄峰面積。以峰7（峰面積較大且保留時(shí)間適中，下同）為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示，10個(gè)共有峰相對(duì)峰面積的RSD均不高于2.56%（n=6），相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不高于0.07%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（編號(hào)Z1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰7為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示，10個(gè)共有峰相對(duì)峰面積的RSD均不高于2.36%（n=6），相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不高于1.49%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一知母藥材粉末（編號(hào)Z1）6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰7為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示，10個(gè)共有峰相對(duì)峰面積的RSD均不高于2.56%（n=6），相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不高于1.82%（n=6），表明所建方法重復(fù)性良好。

2.4.4 28批知母藥材指紋圖譜的建立 取28批知母藥材的供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》分析28批知母藥材的色譜數(shù)據(jù)，以Z1樣品的色譜圖作為參照?qǐng)D譜，利用中位數(shù)法，設(shè)時(shí)間窗寬度為0.2 min，經(jīng)多點(diǎn)校正法生成知母藥材疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜。結(jié)果顯示，28批知母藥材指紋圖譜中共有10個(gè)共有峰;通過(guò)與混合對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出其中7個(gè)峰，分別為新芒果苷（峰1）、芒果苷（峰2）、異芒果苷（峰3）、知母皂苷BⅡ（峰7）、知母皂苷BⅢ（峰8）、知母皂苷Ⅰ（峰9）、知母皂苷AⅢ（峰10）。28批知母藥材疊加指紋圖譜、對(duì)照指紋圖譜和混合對(duì)照品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4.5 相似度評(píng)價(jià) 將28批知母藥材指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，得各批知母藥材的相似度均不低于0.963，說(shuō)明知母栽培品和野生品的化學(xué)成分類似。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 知母藥材多成分含量的測(cè)定

對(duì)28批知母藥材中7個(gè)指認(rèn)共有峰對(duì)應(yīng)成分進(jìn)行含量測(cè)定，以明確知母栽培品和野生品中化學(xué)成分的含量差異。

2.5.1 專屬性考察 取知母栽培品（編號(hào)Z1）和野生品（編號(hào)Y3）的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、空白溶劑（70%乙醇），按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的保留時(shí)間分別為15.93、20.09、21.04、29.72、46.22、51.04、57.44 min，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，空白溶劑不干擾測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖2（混合對(duì)照品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1C，空白溶劑圖略）。

2.5.2 線性關(guān)系考察 以70%乙醇為溶劑，制備不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，其中新芒果苷質(zhì)量濃度分別為0.053、0.107、0.214、0.428、0.860、1.710 mg/mL，芒果苷質(zhì)量濃度分別為0.049、0.099、0.198、0.395、0.790、1.580 mg/mL，異芒果苷質(zhì)量濃度分別為0.003、0.006、0.011、0.023、0.045、0.090 mg/mL，知母皂苷BⅡ質(zhì)量濃度分別為0.073、0.146、0.291、0.583、1.165、2.330 mg/mL，知母皂苷BⅢ質(zhì)量濃度分別為0.009、0.018、0.036、0.073、0.145、0.290 mg/mL，知母皂苷Ⅰ質(zhì)量濃度分別為0.008、0.016、0.032、0.064、0.125、0.250 mg/mL，知母皂苷AⅢ質(zhì)量濃度分別為0.013、0.026、0.052、0.104、0.208、0.415 mg/mL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測(cè)成分峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ在相應(yīng)的定量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，詳見(jiàn)表3。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液適量，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ峰面積的RSD分別為1.46%、1.14%、2.82%、2.14%、2.34%、2.32%、0.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批知母藥材粉末（編號(hào)Z1）6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ峰面積的RSD分別為2.58%、1.58%、2.99%、2.64%、2.84%、2.20%、1.68%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取知母藥材粉末（編號(hào)Z1）6份，分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ含量的RSD分別為2.83%、2.81%、2.63%、1.93%、2.39%、2.32%、1.29%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的知母藥材粉末（編號(hào)Z1）6份，分別加入與知母藥材中各成分質(zhì)量相同的單一對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的平均加樣回收率分別是99.06%、100.53%、98.30%、101.46%、100.17%、96.80%、98.58%，RSD分別為0.36%、0.28%、0.16%、0.82%、0.24%、1.29%、0.68%（n=6）。

2.5.7 樣品含量測(cè)定 按照“2.3”項(xiàng)下方法制備28批知母藥材的供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析（每個(gè)樣品測(cè)定3次），記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算含量。采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05（統(tǒng)計(jì)學(xué)方法下同）。結(jié)果顯示，知母栽培品與野生品中7個(gè)成分的平均總含量分別為74.18、84.72 mg/g，知母栽培品中7個(gè)成分的平均總含量明顯低于野生品（P<0.05）;知母栽培品與野生品中3個(gè)知母雙苯吡酮類成分（新芒果苷、芒果苷、異芒果苷）的平均總含量分別為22.83、21.51 mg/g，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;知母栽培品與野生品中4個(gè)知母皂苷類成分（知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ）的平均總含量分別為51.35、63.21 mg/g，知母野生品中4個(gè)知母皂苷類成分的平均總含量明顯高于栽培品（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 主成分分析 將28批知母藥材中10個(gè)共有峰峰面積的原始數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，前2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到95%;從方差貢獻(xiàn)率來(lái)看，所建模型解釋能力參數(shù)R 2X為1.000，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q 2為0.994，說(shuō)明該主成分分析模型有良好的區(qū)分度和預(yù)測(cè)度。由主成分分析得分圖（圖3）可知，知母栽培品和野生品可被分為兩類。由共有峰峰面積變量載荷圖（圖4）可知，變量對(duì)主成分影響的權(quán)重大小依次為峰2（芒果苷）、峰9（知母皂苷Ⅰ）、峰6、峰5、峰4、峰7（知母皂苷BⅡ）、峰1（新芒果苷）、峰3（異芒果苷）、峰8（知母皂苷BⅢ）、峰10（知母皂苷AⅢ）（峰面積對(duì)主成分的影響權(quán)重由變量離原點(diǎn)的距離判斷，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，變量對(duì)主成分的影響權(quán)重越大[8]）。

2.6.2 正交偏最小二乘法-判別分析 在進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督的主成分分析后，進(jìn)一步對(duì)28批知母藥材中10個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析，在95%置信區(qū)間內(nèi)，選取變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值>1的成分作為差異性成分[9-10]。結(jié)果顯示，所建模型對(duì)X和Y矩陣的解釋能力參數(shù)R 2X和R 2Y分別為1.000、0.918，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q 2為0.691，說(shuō)明該模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力均較好。由正交偏最小二乘法-判別分析得分圖（圖5）可知，知母栽培品和野生品可被分為兩類。由VIP值結(jié)果（圖6）可知，峰2、峰7、峰1、峰10的VIP值均大于1，初步確定其對(duì)應(yīng)的芒果苷、知母皂苷BⅡ、新芒果苷、知母皂苷AⅢ可作為區(qū)分知母栽培品和野生品的差異性成分。

2.7 知母栽培品和野生品中差異性成分的含量比較

采用t檢驗(yàn)比較28批知母藥材中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ的含量差異。結(jié)果顯示，知母栽培品中新芒果苷的含量明顯高于知母野生品[（17.58±3.68）mg/g vs.（9.04±3.72）mg/g，P<0.05]，芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ的含量均明顯低于知母野生品[芒果苷：（4.76±1.55）mg/g vs.（11.60±1.65）mg/g，知母皂苷BⅡ：（44.03±1.31）mg/g vs.（46.67±3.86）mg/g，知母皂苷AⅢ：（4.37±2.91）mg/g vs.（8.88±2.28）mg/g，P<0.05]，詳見(jiàn)圖7。

3 討論

知母中富含甾體皂苷類成分，在200～800 nm波長(zhǎng)內(nèi)無(wú)吸收，因而紫外檢測(cè)器不適用于知母甾體皂苷類成分的測(cè)定。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是通用型檢測(cè)器，可以同時(shí)檢測(cè)知母中的雙苯吡酮類和皂苷類成分。因此，本研究采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，以高效液相色譜法對(duì)28批知母藥材進(jìn)行定性、定量分析。筆者前期首先對(duì)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括漂移管溫度（70、80、90 ℃）、霧化溫度（90、100 ℃）、載氣流速（0.8、1.2、1.6、2 mL/min）。結(jié)果顯示，當(dāng)漂移管溫度為70 ℃、霧化溫度為90 ℃、載氣流速為1.6 mL/min時(shí)，所得圖譜基線平穩(wěn)、靈敏度高、分離度好。其次對(duì)知母藥材的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，以7個(gè)指認(rèn)共有峰對(duì)應(yīng)的成分總含量為指標(biāo)，分別對(duì)料液比（1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50，g/mL）、超聲時(shí)間（20、30、40 min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（100%、70%、50%、25%）進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，最優(yōu)提取條件如下：料液比1 ∶ 40（g/mL）、超聲時(shí)間30 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

本研究收集了河北、安徽、山東、山西、陜西、內(nèi)蒙古等6個(gè)省份的14批知母野生品和14批知母栽培品，建立了知母藥材的指紋圖譜。結(jié)果顯示，28批知母藥材的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均不低于0.963，所建立的指紋圖譜可用于知母藥材的鑒定和質(zhì)量控制。但指紋圖譜各共有峰的峰面積大小各異，表明兩者成分含量存在一定差異性。

2020年版《中國(guó)藥典》（一部）將芒果苷和知母皂苷BⅡ作為知母的質(zhì)控指標(biāo)[1]，單以這兩個(gè)成分難以全面反映知母的整體質(zhì)量與品質(zhì)。本研究對(duì)28批知母藥材中7個(gè)指認(rèn)共有峰對(duì)應(yīng)成分進(jìn)行含量測(cè)定，并結(jié)合主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析對(duì)知母栽培品和野生品進(jìn)行比較與判別。結(jié)果顯示，知母栽培品中7個(gè)成分的平均總含量明顯低于野生品，知母栽培品與野生品中3個(gè)雙苯吡酮類成分的平均總含量無(wú)明顯差異，知母野生品中4個(gè)知母皂苷類成分的平均總含量明顯高于栽培品。主成分分析及正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果表明，知母栽培品和野生品可被分為兩類。初步篩選出影響知母栽培品和野生品藥材質(zhì)量的4個(gè)差異性成分，分別為新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ。已有研究報(bào)道，新芒果苷具有改善結(jié)腸炎、非酒精性脂肪肝等藥理作用[11-12]，芒果苷具有抑制心肌纖維化、降血壓、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等作用[13-16]，知母皂苷BⅡ具有抗氧化應(yīng)激損傷、治療帕金森、治療老年癡呆等作用[13，17-18]，知母皂苷AⅢ具有抗腫瘤、抗肝毒性等作用[19-21]，可能是知母藥材的活性成分。本研究依據(jù)這4個(gè)成分的含量對(duì)28批知母藥材進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)知母栽培品中新芒果苷的含量明顯高于野生品，芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ的含量均明顯低于野生品。

本研究成功建立了知母藥材的指紋圖譜，可用于知母藥材的鑒定和質(zhì)量控制;初步確認(rèn)了知母野生品和栽培品的差異性成分（新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ），為區(qū)分知母野生品與栽培品提供了參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社：2020：222-223.

[ 2 ] 石秋杰.周耀庭教授治療發(fā)熱性疾病經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2021，19（6）：57-60.

[ 3 ] 鐘可，王文全，靳鳳云，等.知母的HPLC-ELSD指紋圖譜研究[J].中草藥，2016，47（15）：2747-2750.

[ 4 ] 陳震霖，張碩.加減桂枝芍藥知母湯合益腎除濕丸治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效觀察[J].中成藥，2017，39（7）：1539-1541.

[ 5 ] 劉靜，黨院霞，高英，等.知母-黃柏藥對(duì)有效部位群改善2型糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙的藥效及機(jī)制研究[J].中草藥，2017，48（19）：4037-4043.

[ 6 ] DU H L，ZHAO H X，LAI X L，et al. Metabolic profiles revealed synergistically antidepressant effects of lilies and Rhizoma Anemarrhenae in a rat model of depression[J]. Biomed Chromatogr，2017，31（7）：e3923.

[ 7 ] 趙小勤，許莉，文永盛，等. UPLC-QQQ-MS/MS法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地知母中10種成分[J].中成藥，2020，42（4）：980-985.

[ 8 ] 王玉勤，范國(guó)榮.基于指紋圖譜結(jié)合多模式化學(xué)計(jì)量學(xué)方法評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂藥材質(zhì)量[J].中草藥，2021，52（4）：1143- 1150.

[ 9 ] 林麗，李歡歡，謝輝，等.基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的旋覆花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J].中草藥，2021，52（6）：1751-1758.

[10] 楊冰月，彭亮，顏永剛，等. HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析不同產(chǎn)地款冬花生品與蜜炙品[J].中草藥，2018，49（21）：4991-4997.

[11] ZHOU C Y，ZHOU J J，HAN N，et al. Beneficial effects of neomangiferin on high fat diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in rats[J]. Int Immunopharmacol，2015，25（1）：218-228.

[12] LIM S M，KANG G D，JEONG J J，et al. Neomangiferin modulates the Th17/Treg balance and ameliorates colitis in mice[J]. Phytomedicine，2016，23（2）：131-140.

[13] OU G，CHEN W Y，YANG M Y，et al. Preventive effect of nasal timosaponin BⅡ-loaded temperature-/ion-sensitive in situ hydrogels on Alzheimers disease[J]. J Tradit Chin Med Sci，2021，8（1）：59-64.

[14] SONG J N，MENG Y X，WANG M，et al. Mangiferin activates Nrf2 to attenuate cardiac fibrosis via redistributing glutaminolysis-derived glutamate[J]. Pharmacol Res，2020，157：104845.

[15] 辛田田，廖承譜，蒙玉梅，等.芒果苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠T淋巴細(xì)胞亞群和炎性因子的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2020，47（3）：194-197.

[16] 張蕾.芒果苷對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞的抑制作用及抗腫瘤機(jī)制研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2019.

[17] XIE Q M，ZHAO H X，LI N，et al. Protective effects of timosaponin BⅡ on oxidative stress damage in PC12 cells based on metabolomics[J]. Biomed Chromatogr， 2018， 32（10）： e4321.

[18] 張錦坤，周夢(mèng)琪，馬浩潔，等.知母皂苷B-Ⅱ?qū)PP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞帕金森病模型線粒體的保護(hù)作用[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，43（12）：1027-1033.

[19] 譚希，潘會(huì)君，吳偉達(dá)，等.知母皂苷AⅢ抑制人腦膠質(zhì)瘤增殖生長(zhǎng)的機(jī)制研究[J].中國(guó)中藥雜志，2017，42（6）：1160-1166.

[20] WU Z T，QI X M，SHENG J J，et al. Timosaponin A3 induces hepatotoxicity in rats through inducing oxidative stress and down-regulating bile acid transporters[J]. Acta Pharmacol Sin，2014，35（9）：1188-1198.

[21] MARELIA C B，SHARP A E，SHEMWELL T A，et al. Anemarrhena asphodeloides Bunge and its constituent timosaponin-AⅢ induce cell cycle arrest and apoptosis in pancreatic cancer cells[J]. FEBS Open Bio，2018，8（7）：1155-1166.

（收稿日期：2021-08-12 修回日期：2021-12-08）

（編輯：鄒麗娟）