枇杷葉生品及不同炮制品質量評價

高偉城 王小平 何麗珊

中圖分類號 R282 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）02-0196-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.02.12

摘 要 目的 評價枇杷葉生品及不同炮制品的質量。方法 將10批枇杷葉生品分別制成蜜炙枇杷葉、姜汁炙枇杷葉、姜汁煮枇杷葉、甘草汁炙枇杷葉、甘草汁煮枇杷葉、清炒枇杷葉，共70批樣品。采用熱浸法測定其醇溶性浸出物含量，采用紫外-可見分光光度法測定其總三萜酸含量（以熊果酸計），采用高效液相色譜法測定其中野鴉椿酸等5個三萜酸類成分的含量;采用高效液相色譜法聯合《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》建立指紋圖譜并進行相似度評價，與混合對照品比對指認共有峰。采用SPSS 22.0軟件和SIMCA-P 14.1軟件進行系統聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析。結果 枇杷葉生品、蜜炙枇杷葉、姜汁炙枇杷葉、姜汁煮枇杷葉、甘草汁炙枇杷葉、甘草汁煮枇杷葉、清炒枇杷葉中醇溶性浸出物平均測定值分別為25.90%、39.95%、27.44%、28.20%、28.38%、26.36%、29.26%，總三萜酸平均含量分別為40.62、49.33、52.56、46.38、52.17、55.06、53.41 mg/g，野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸的平均含量和平均總含量分別為1.966～4.808、1.459～2.824、4.525～8.172、1.294～1.817、6.294～8.470、15.538～25.671 mg/g。70批樣品中有11個共有峰，指認出峰2、5、6、10、11分別為野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸。枇杷葉生品及不同炮制品與生品指紋圖譜的相似度為0.919～1.000。70批樣品中，10批枇杷葉生品聚為一類，10批姜汁煮枇杷葉聚為一類，其他50批枇杷葉炮制品聚為一類;前2個主成分的累計方差貢獻率為80.682%;變量投影重要性（VIP）值排序為峰2（野鴉椿酸）>峰5（山楂酸）>峰6（科羅索酸）>峰9（未知成分）>峰11（熊果酸）>峰10（齊墩果酸），其值均大于1。結論 枇杷葉生品經炮制后，醇溶性浸出物、總三萜酸含量和5個三萜酸類成分（野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸）總含量均有不同程度的增加，其中蜜炙枇杷葉中醇溶性浸出物最高，甘草汁煮枇杷葉中總三萜酸含量最高，姜汁煮枇杷葉中5個三萜酸類成分總含量最高。野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、熊果酸、齊墩果酸等成分可能是影響枇杷葉生品及炮制品質量的差異性成分。

關鍵詞 枇杷葉;炮制品;醇溶性浸出物;三萜酸類成分;指紋圖譜;化學模式識別;質量評價

Quality evaluation of crude drug and different processed products of Eriobotryae Folium

GAO Weicheng，WANG Xiaoping，HE Lishan（Dept. of Pharmacy， Zhangzhou Health Vocational College， Fujian Zhangzhou 363000， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To evaluate the quality of crude drug and different processed products of Eriobotryae Folium. METHODS Ten batches of Eriobotryae Folium were processed into honey-stir-baked Eriobotryae Folium， ginger-juice-stir-baked Eriobotryae Folium， ginger-juice-boiled Eriobotryae Folium， licorice-juice-stir-baked Eriobotryae Folium， licorice-juice-boiled Eriobotryae Folium， stir-fried Eriobotryae Folium， totally 70 batches of samples. The contents of alcohol-soluble extracts， the contents of total triterpene acids （calculated by ursolic acid） and five triterpene acids such as euscaphic acid were determined by hot-dipping method， ultraviolet and visibe spectrophotometry and high performance liquid chromatography （HPLC）， respectively. The fingerprints were established with HPLC and their similarity evaluation was conducted with Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2004A）. Common peaks were identified by comparison with mixed control. Hierarchical clustering analysis， principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA） were performed by using SPSS 22.0 software and SIMCA-P 14.1 software. RESULTS In Eriobotryae Folium， honey-stir-baked Eriobotryae Folium， ginger-juice-stir-baked Eriobotryae Folium， ginger-juice-boiled Eriobotryae Folium， licorice-juice-stir-baked Eriobotryae Folium， licorice-juice-boiled Eriobotryae Folium， stir-fried Eriobotryae Folium， average contents of alcohol-soluble extracts were 25.90%， 39.95%， 27.44%， 28.20%， 28.38%， 26.36% and 29.26%; average contents of total triterpene acids were 40.62， 49.33， 52.56， 46.38， 52.17， 55.06 and 53.41 mg/g; average contents of euscaphic acid， crataegolic acid， corosolic acid， oleanolic acid， ursolic acid and average total content were 1.966-4.808， 1.459-2.824， 4.525-8.172， 1.294-1.817， 6.294-8.470， 15.538-25.671 mg/g， respectively. There were 11 common peaks in 70 batches of samples， and the peak 2， 5， 6， 10 and 11 were identified as euscaphic acid， crataegolic acid， corosolic acid， oleanolic acid and ursolic acid. The similarities of crude drug and different processed products with crude drug fringerprint were 0.919-1.000. Among 70 batches of samples， 10 batches of Eriobotryae Folium could be clustered into one category， and 10 batches of ginger-juice-boiled Eriobotryae Folium could be clustered into one category; other 50 batches of processed products of Eriobotryae Folium could be clustered into one category; the cumulative variance contribution rate of the first two principal components was 80.682%; variable importance in projection （VIP） value was in descending order， i.e. peak 2 （euscaphic acid）>peak 5 （crataegolic acid）>peak 6 （corosolic acid）>peak 9 （unknown component） >peak 11 （ursolic acid）>peak 10 （oleanolic acid）， which of them were all higher than 1. CONCLUSIONS After processing， the contents of alcohol-soluble extracts， total triterpene acids and the total content of five triterpene acids （euscaphic acid， crataegolic acid， corosolic acid， oleanolic acid and ursolic acid） increased in varying degrees， among which the content of alcohol-soluble extracts in honey-stir-baked Eriobotryae Folium was the highest， the content of total triterpene acids in licorice-juice-boiled Eriobotryae Folium was the highest， and total content of five triterpene acids ?in ginger- juice-boiled Eriobotryae Folium was the highest. Euscaphic acid， crataegolic acid， corosolic acid， ursolic acid， oleanolic acid and other components may be the differential components affecting the quality of raw and processed the leaves from ?Eriobotryae Folium.

KEYWORDS ? Eriobotryae Folium; processed product; alcohol-soluble extracts; triterpene acids; fingerprint; chemical pattern recognition; quality evaluation

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥葉，能清肺止咳、降逆止嘔[1]。該藥首載于《名醫別錄》，列為中品[2]。現代研究表明，枇杷葉的重要藥效成分為野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸等三萜酸類[3];其乙醇提取物具有鎮咳等作用[4]。枇杷葉炮制歷史悠久，從晉代至今的炮制方法有蜜炙、姜汁炙、姜汁煮、甘草汁炙、甘草汁煮、炒制等[5]，如2020年版《中國藥典》（一部）收載有枇杷葉生品和蜜炙品[1];《上海市中藥飲片炮制規范（2018年版）》收載有清炒枇杷葉[6];《圣濟總錄》中記載，“治傷寒干嘔，煩渴不止。枇杷葉去毛姜汁炙”[7];《本草綱目》中曰，“凡用拭去毛，甘草湯洗再試”[7]。枇杷葉不同炮制品的臨床應用廣泛，蜜炙枇杷葉多用于治療肺燥咳嗽;姜汁制枇杷葉多用于和胃止嘔;甘草制枇杷葉多用于祛痰止咳;清炒枇杷葉少了滋膩之性，多用于治療外感咳嗽、嘔吐[5]。可見，不同炮制方法可直接影響枇杷葉的臨床功效，故很有必要對其不同炮制品的藥效物質及化學成分進行分析。

本文通過分析枇杷葉生品及不同炮制品醇溶性浸出物、總三萜酸（以熊果酸計）和5個三萜酸類成分（野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸）含量的差異，結合指紋圖譜和化學模式識別方法研究不同炮制方法對枇杷葉中化學成分含量的影響，以期為枇杷葉生品及其炮制品的質量評價和臨床選擇提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、XSE205DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、OHAUS PX224ZH/E型萬分之一電子分析天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]、FST-Ⅲ-10精密型超純水機（上海富詩特儀器設備有限公司）、XL-10B型中藥粉碎機（廣州旭朗機械設備有限公司）、KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、HWS-2型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）、電熱鼓風高溫干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

10批枇杷葉（定名為“早鐘6號”）藥材均于2020年10月采集自福建省漳州市云霄縣火田鎮，用沸水燙3 min，取出晾干，再用鼓風高溫干燥箱于70 ℃下烘干4 h;甘草飲片（批號20180801）購自江西藥都堂中藥飲片有限公司;生姜飲片（批號20200703）購自漳州新華都百貨有限責任公司。上述藥材/飲片經我院中藥教研室王小平教授鑒定，分別為薔薇科植物枇杷E. japonica（Thunb.）Lindl.的干燥葉，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖，以及姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鮮根莖。

野鴉椿酸對照品（批號MUST-21011201，純度98.73%）、山楂酸對照品（批號MUST-20062813，純度99.79%）、科羅索酸對照品（批號MUST-20061305，純度99.79%）、齊墩果酸對照品（批號MUST-19032706，純度98.33%）、熊果酸對照品（批號MUST-19062710，純度98.46%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司;蜂蜜（批號20200090）購自北京同仁堂蜂產品（江山）有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 生品及炮制品的制備

2.1.1 枇杷葉生品 取干燥的枇杷葉，切絲，制得枇杷葉生品樣品（編號S1-1～S1-10）[1]。

2.1.2 蜜炙枇杷葉 取上述枇杷葉絲，加蜜水（將蜂蜜制成煉蜜，并用沸水稀釋成蜜水，煉蜜與水的質量比為2 ∶ 1）拌勻，悶透，置于鍋內，用文火炒至不黏手時取出，晾干，制得蜜炙枇杷葉樣品（編號S2-1～S2-10）[8]。每100 g枇杷葉絲用煉蜜25 g。

2.1.3 姜汁炙枇杷葉 取上述枇杷葉絲，加姜汁（加水將生姜搗成姜汁，所得姜汁與生姜的質量比為1 ∶ 1）拌勻，悶透，置于鍋內，用文火炒至姜汁被吸盡，取出，晾干，制得姜汁炙枇杷葉樣品（編號S3-1～S3-10）[7]。每100 g枇杷葉絲用生姜10 g。

2.1.4 姜汁煮枇杷葉 取上述枇杷葉絲，加水沒過藥材和生姜一起煮至水被吸盡后，文火炒干，取出，制得姜汁煮枇杷葉樣品（編號S4-1～S4-10）[7]。每100 g枇杷葉絲用生姜10 g。

2.1.5 甘草汁炙枇杷葉 取上述枇杷葉絲，加甘草汁（每1 g甘草加水煮成1.5 g甘草汁）拌勻，悶透，置于鍋內，用文火炒至甘草汁被吸盡，取出，晾干，制得甘草汁炙枇杷葉樣品（編號S5-1～S5-10）[7]。每100 g枇杷葉絲用甘草6 g。

2.1.6 甘草汁煮枇杷葉 取上述枇杷葉絲，加水沒過藥材和甘草一起煮至水被吸盡后，文火炒干，取出，制得甘草汁煮枇杷葉樣品（編號S6-1～S6-10）[7]。每100 g枇杷葉絲用甘草6 g。

2.1.7 清炒枇杷葉 取上述枇杷葉絲，置于鍋內，用文火炒至微具焦斑，篩去灰屑，制得清炒枇杷葉樣品（編號S7-1～S7-10）[6]。

2.2 枇杷葉生品及不同炮制品醇溶性浸出物的測定

根據2020年版《中國藥典》（四部）通則“2201浸出物測定法”，以75%乙醇為溶劑，采用熱浸法測定10批枇杷葉生品及不同炮制品中醇溶性浸出物的含量[8]。結果顯示，枇杷葉生品及不同炮制品的醇溶性浸出物含量都符合2020年版《中國藥典》（一部）要求[1]，且炮制后枇杷葉醇溶性浸出物均有所增加，其中蜜炙枇杷葉增加幅度最大，增幅達到了54.25%。枇杷葉生品及不同炮制品中醇溶性浸出物平均含量的高低順序依次為蜜炙枇杷葉>清炒枇杷葉>甘草汁炙枇杷葉>姜汁煮枇杷葉>姜汁炙枇杷葉>甘草汁煮枇杷葉>枇杷葉生品。結果見表1。

2.3 總三萜酸含量的測定

采用紫外-可見分光光度法進行測定。

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取熊果酸對照品適量，置于10 mL量瓶中，加95%乙醇超聲（功率250 W，頻率50 kHz，下同）溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為86.4 μg/mL的對照品溶液[9]。

2.3.2 供試品溶液的制備 取樣品粗粉約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，加95%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液1 mL，用95%乙醇定容于25 mL量瓶中，備用。

2.3.3 方法學考察 使用紫外-可見分光光度計在550 nm波長處測定熊果酸的吸光度（A）。以A值為縱坐標、熊果酸質量濃度（c，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為A=0.071 1c-0.056（r=0.999 6），熊果酸檢測質量濃度的線性范圍為2.88～14.4 μg/mL;精密度、穩定性（24 h）、重復性試驗的RSD均小于2%（n=6）;平均加樣回收率為97.88%（RSD=1.96%，n=6）。具體內容參看文獻[9]。

2.3.4 樣品中總三萜酸的含量測定 精密吸取10批枇杷葉生品及不同炮制品的供試品溶液各1 mL，按照“2.3.3”項下方法測定吸光度并代入回歸方程計算總三萜酸含量。結果顯示，枇杷葉生品經炮制后總三萜酸含量均增加，其中甘草汁煮枇杷葉的總三萜酸含量最高，增幅達到了35.55%。枇杷葉生品及不同炮制品中總三萜酸平均含量的高低順序依次為甘草汁煮枇杷葉>清炒枇杷葉>姜汁炙枇杷葉>甘草汁炙枇杷葉>蜜炙枇杷葉>姜汁煮枇杷葉>枇杷葉生品。結果見表2。

2.4 野鴉椿酸等5個三萜酸類成分含量的測定

采用高效液相色譜法進行測定。

2.4.1 色譜條件 以Shim-pack Scepter HD-C18-80（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-甲醇（B）-0.5%乙酸銨溶液（C）為流動相進行梯度洗脫（0～20 min，3%A→15%A，76%B→64%B，21%C;20～50 min，15%A→20%A，64%B→59%B，21%C）;流速為1.0 mL/min;柱溫為40 ℃;檢測波長為210 nm;進樣量為20 μL。

2.4.2 溶液的配制 （1）混合對照品溶液：精密稱取野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸對照品各適量，置于同一量瓶中，加95%乙醇超聲溶解并定容，制成每1 mL分別含上述對照品1 090、755、1 350、275、1 515 μg的混合對照品溶液，備用。（2）供試品溶液：取枇杷葉生品及不同炮制品粗粉各約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，加95%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，再過0.45 μm微孔濾膜，備用。（3）輔料溶液的制備：分別取蜜水0.25 g、姜汁0.1 g、甘草汁1.25 g，分別按照“2.4.2（2）”項下方法制備輔料溶液，備用。

2.4.3 專屬性考察 精密吸取“2.4.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液（編號S1-1～S7-1）、輔料溶液各20 μL，按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。結果顯示，混合對照品溶液中，野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數按熊果酸峰計均大于5 000;各供試品溶液的主要色譜峰信息接近，圖譜中5個已知色譜峰達到基線分離且保留時間與混合對照品溶液圖譜一致;各輔料溶液對上述成分的測定無干擾。此外，姜汁炙枇杷葉供試品溶液（編號S3-1）圖譜中新增加了1個色譜峰，經與輔料姜汁圖譜對比，確認該新增色譜峰對應成分為姜汁成分。

2.4.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液1、2、3、4、5、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表3。

2.4.5 精密度、重復性、穩定性、加樣回收率考察 （1）精密度試驗：精密吸取“2.4.4”項下混合對照品溶液（含野鴉椿酸545 μg/mL、山楂酸377.5 μg/mL、科羅索酸675 μg/mL、齊墩果酸137.5 μg/mL、熊果酸757.5 μg/mL），按照“2.4.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明儀器精密度良好。（2）重復性試驗：取同一枇杷葉生品（編號S1-1）6份，按照“2.4.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入回歸方程計算含量。結果顯示，野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸含量的RSD均小于3%（n=6），表明該方法重復性良好。（3）穩定性試驗：取同一供試品溶液（編號S1-1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、24 h時按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。（4）加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的枇杷葉生品（編號S1-1）9份，每3份為1組，分別按已知量的80%、100%、120%加入混合對照品溶液，按照“2.4.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸的平均加樣回收率為98.21%～101.82%，RSD均小于3%（n=3）。

2.4.6 樣品中5個三萜酸類成分的含量測定 分別取枇杷葉生品及不同炮制品適量，按照“2.4.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入回歸方程計算含量。結果顯示，枇杷葉生品經炮制后，野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸5個成分的含量均出現不同程度的增加，其中姜汁煮枇杷葉的野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸的含量增加最多，甘草汁煮枇杷葉中的齊墩果酸、熊果酸的含量增加最多。5個三萜酸類成分平均總含量的高低順序依次為姜汁煮枇杷葉>甘草汁炙枇杷葉>清炒枇杷葉>甘草汁煮枇杷葉>姜汁炙枇杷葉>蜜炙枇杷葉>枇杷葉生品。結果見表4。

2.5 枇杷葉生品及不同炮制品指紋圖譜的建立

采用高效液相色譜法操作。

2.5.1 色譜條件 同“2.4.1”項。

2.5.2 溶液的配制 同“2.4.2”項。

2.5.3 精密度、重復性、穩定性考察 （1）精密度試驗：取枇杷葉生品供試品溶液（編號S1-1）適量，按照“2.5.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以熊果酸色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，11個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明該方法精密度良好。（2）重復性試驗：取枇杷葉生品（編號S1-1）2 g，共6份，按照“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，以熊果酸色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，11個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明該方法重復性良好。（3）穩定性試驗：取枇杷葉生品供試品溶液（編號S1-1）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24、48 h時按照“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，以熊果酸色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，11個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內穩定性良好。

2.5.4 指紋圖譜建立與相似度評價 將枇杷葉生品及不同炮制品的色譜信息導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》，選擇S1-1圖譜為參照，設定時間窗寬度為0.4 s，以中位數法自動匹配生成疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）并進行相似度分析。結果顯示，70批枇杷葉生品及不同炮制品的指紋圖譜中有11個共有峰;與混合對照品溶液色譜圖（圖1中的“S”）比對，指認峰2、5、6、10、11分別為野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸。與S1-1圖譜進行比較，各批枇杷葉生品、蜜炙枇杷葉、姜汁炙枇杷葉、姜汁煮枇杷葉、甘草汁炙枇杷葉、甘草汁煮枇杷葉、清炒枇杷葉的相似度分別為0.995～1.000、0.966～0.977、0.984～0.987、0.919～0.930、0.966～0.970、0.959～0.966、0.969～0.983。由此可見，枇杷葉生品與6種枇杷葉炮制品存在一定差異，說明經炮制后枇杷葉成分的含量均有變化，其中姜汁煮枇杷葉的變化最為明顯。70批枇杷葉生品及不同炮制品的對照指紋圖譜和疊加指紋圖譜見圖2。

2.6 化學模式識別分析

2.6.1 系統聚類分析 將70批樣品11個共有峰的峰面積信息導入SPSS 22.0軟件，采用組間連接法進行系統聚類分析[10]。結果顯示，當平方歐氏距離>10時，70批樣品可分為三大類，枇杷葉生品S1-1～S1-10為一類，姜汁煮枇杷葉S4-1～S4-10為一類，其余為一類，該結果與相似度分析結果基本一致。70批枇杷葉生品及不同炮制品的聚類分析樹狀圖見圖3。

2.6.2 主成分分析 將70批樣品11個共有峰的峰面積信息導入SPSS 22.0軟件，標準化處理后進行因子載荷矩陣分析并計算方差貢獻率，以特征值>1為標準篩選主成分[10]。結果顯示，前2個主成分的累計方差貢獻率為80.682%;第1主成分的方差貢獻率為70.967%，主要反映共有峰2～11，其中峰2為野雅椿酸、峰5為山楂酸、峰6為科羅索酸、峰10為齊墩果酸、峰11為熊果酸;第2主成分的方差貢獻率為9.715%，主要反映峰1，該峰對應成分未知。70批枇杷葉生品及不同炮制品中前2個主成分的特征值和方差貢獻率見表5。

2.6.3 正交偏最小二乘法-判別分析 將70批樣品11個共有峰的峰面積信息導入SIMCA-P 14.1軟件中進行正交偏最小二乘法-判別分析。結果顯示，枇杷葉生品、姜汁煮枇杷葉與其他炮制品差異明顯，詳見圖4。以變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值大于1為依據[11]，篩選出對差異貢獻較大的色譜峰有6個，貢獻大小依次為峰2（野鴉椿酸）>峰5（山楂酸）>峰6（科羅索酸）>峰9>峰11（熊果酸）>峰10（齊墩果酸），詳見圖5。結果表明，上述6個共有峰對應成分對枇杷葉生品及不同炮制品質量差異的影響較大。

3 討論

3.1 色譜條件的考察

山楂酸和科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸均為三萜酸類同分異構體，較難分離。筆者在借鑒文獻[9，12-13]及前期研究的基礎上，分別考察了Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）等色譜柱及乙腈-0.1%磷酸鹽緩沖溶液、甲醇-0.1%磷酸鹽緩沖溶液等不同流動相對野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸5個成分含量測定的影響。結果顯示，在本研究色譜條件下，野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸等5個成分的分離度均大于1.5，可實現基線分離。

3.2 醇溶性浸出物、總三萜酸及5個三萜酸類成分分析

2020年版《中國藥典》（一部）枇杷葉項下規定：醇溶性浸出物不得少于18.0%（生品）、16.0%（蜜炙）;含齊墩果酸和熊果酸的總量不得少于0.70%[1]。本研究結果顯示，枇杷葉生品及不同炮制品的醇溶性浸出物平均含量為25.90%～39.95%，齊墩果酸和熊果酸的平均總量為0.759%～1.029%（即7.588～10.287 mg/g），均符合上述規定。

有研究表明，枇杷葉乙醇提取物有明顯的止咳作用和改善急性肺損傷作用[14-15]，三萜酸類成分是枇杷葉抗炎、止咳的活性成分[14]。本研究結果表明，枇杷葉生品經炮制后，醇溶性浸出物、總三萜酸含量和5個三萜酸類成分的總含量均有不同程度的增加。其中，蜜炙枇杷葉中醇溶性浸出物最高，進一步驗證了“潤肺止咳宜蜜炙用”這一傳統中醫理論，可為枇杷葉經蜜炙后增強潤肺止咳作用提供理論依據;甘草汁煮枇杷葉中總三萜酸含量最高，可為甘草制枇杷葉增加祛痰止咳作用提供理論依據;姜汁煮枇杷葉中5個三萜酸類成分的總含量最高，可為姜制枇杷葉增加止咳作用提供理論依據。另有研究報道，枇杷葉經炮制后熊果酸的含量均高于生品，并且姜湯煮品>姜汁炒品>生品[16]，本文研究結果與之相符。本研究結果表明，枇杷葉經炮制后5個三萜酸類成分（野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸）總含量都高于生品，原因可能為這5個三萜酸類成分以鹽或苷的形式存在于枇杷葉生品中，經炮制后分解，也可能是其他成分經炮制后轉化，具體原因有待進一步研究。

綜上所述，枇杷葉生品經炮制后，醇溶性浸出物、總三萜酸含量和5個三萜酸類成分（野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸）總含量均有不同程度的增加，其中蜜炙枇杷葉中醇溶性浸出物最高，甘草汁煮枇杷葉中總三萜酸含量最高，姜汁煮枇杷葉中5個三萜酸類成分總含量最高。野鴉椿酸、山楂酸、科羅索酸、熊果酸、齊墩果酸等成分可能是影響枇杷葉生品及炮制品質量的差異性成分。

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（收稿日期：2021-08-01 修回日期：2021-12-08）

（編輯：鄒麗娟）