黃芪甲苷提取與純化工藝的研究進展

李燕中，李 強，鄔學清，吳亞麗，金 宏，劉拴成

(1.集寧師范學院 化學與化工學院；2.集寧師范學院 生命科學與技術學院，內蒙古 烏蘭察布 012000)

黃芪為豆科多年生藥用草本植物，是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，作為天然中草藥，又名綿芪、綿黃芪，有“補藥之長”的美稱[1,2]。《中國藥典》中記載黃芪包括蒙古黃芪和膜莢黃芪兩種，蒙古黃芪主要分布在我國的內蒙古、河北、山西等地；膜莢黃芪分布于吉林、遼寧、黑龍江、河北、內蒙古、山西、陜西和甘肅等地。其藥性溫和、味甘，有補氣升陽、止汗固表、利水消腫、排膿托毒、行滯通痹等臨床功效，可用于氣虛乏力、中氣下陷、表虛自汗、氣虛水腫、血虛萎黃等的治療[1]。黃芪作為一種免疫促進劑或免疫調節劑在人醫臨床已廣泛應用，同時黃芪作為飼料添加劑還能夠改善動物生長性能，增強多種動物的免疫功能[3]，并且黃芪還可作為外源性抗氧化劑，提高機體抗氧化能力，改善肉質和風味，延緩酸敗程度[4,5]。

黃芪的化學成分眾多，主要含有多糖類、皂苷類、黃酮類及氨基酸類等。黃芪甲苷是黃芪中的主要活性成分之一，是目前評價黃芪質量及黃芪制劑質量的重要指標性成分[6,7]。黃芪甲苷具有增強免疫功能、抗炎、降壓、穩定紅細胞膜、提高血漿環磷酸腺苷(cAMP)含量和促進小鼠再生肝DNA合成等多種作用[8,9]。

1 黃芪甲苷提取方法和工藝現狀及存在的問題

中藥提取有著久遠的歷史，煎煮法、冷浸漬法、回流法、索氏提取法等都是傳統的提取分離手段[10]。目前，黃芪甲苷提取方法常采用浸泡提取法、索氏提取器提取法、超臨界流體萃取法和發酵法[11，12]，純化方法常用大孔樹脂吸附法和堿化處理法。雖然也有研究人員提出超聲提取法、微波輔助萃取法、超高壓提取法、加速溶劑萃取法等，但實際生產中應用較少。

判斷黃芪甲苷提取工藝是否優良可以考慮以下幾個因素：①黃芪甲苷得率的高低；②整個工藝流程是否經濟；③黃芪甲苷的活性。常規提取工藝往往存在提取效率低、提取時間長、雜質含量大、溶劑消耗大、操作流程復雜等缺點，阻礙了黃芪甲苷的研究與開發。因此，筆者總結了近年有關黃芪甲苷提取工藝的研究，以便為后續黃芪甲苷的研究開發提供依據。

2 黃芪甲苷提取方法和工藝的研究進展

近年來，有不少關于黃芪甲苷提取工藝改進與優化的研究報道，常用的提取方法和工藝主要分以下幾類。

2.1 熱提法

熱提法主要包括煎煮法、回流提取法以及連續提取法，是一種傳統提取方法，一直沿用至今。研究人員在使用熱提法過程中不斷優化黃芪甲苷的熱提條件。一些研究人員對黃芪甲苷提取工藝進行了正交實驗的研究[13-16]，其中，昝麗霞選取了黃芪甲苷含量、干膏收率、總黃酮含量指標，考察了影響黃芪中有效成分提取的因素，結果顯示，乙醇濃度為70%時，在70℃下，以1∶12的料液比提取3 h，測得干膏有25%左右得率，黃芪甲苷含量超過3%[13]。在該工藝條件下，優選出的黃芪乙醇提取工藝相對科學、經濟，能有效節約資源，可進一步開展用于工業生產的研究。

馬雪松等對比了回流提取法與煎煮法，選取指標為黃芪甲苷得率，考查了提取方法和影響因素。結果表明，藥材充分粉碎后，經8 h預浸泡，pH值均對煎煮法和回流提取法產生了主要影響，在pH值為12時，煎煮法在60℃下首次煎煮1 h是最佳提取條件，而回流提取法所用乙醇用量為藥材質量的6倍，乙醇體積分數為60%時提取效果最好[14]。

黃際薇以黃芪甲苷含量為指標進行正交試驗，考察了藥材粒徑、浸泡時間和提取次數的影響因素，篩選出黃芪甲苷提取最佳工藝條件是過40目篩的藥材經浸泡時間6 h，3次提取[16]。

張素清等采用醇提法，以黃芪甲苷提取量為指標，通過正交試驗分析與R語言結合BP神經網絡及遺傳算法，優化了黃芪中有效成分黃芪甲苷的提取工藝。結果表明R語言結合BP神經網絡模型具有良好的預測性，為優化中藥材提取及相關制劑工藝提出了一種新的優化方法[17]。

2.2 超臨界流體萃取法

宋振民等以黃芪甲苷的含量為指標，采用正交試驗法，優化了肺痿顆粒中黃芪甲苷的超臨界CO2萃取最佳工藝。結果顯示該優選工藝有效成分提取率高，最佳提取工藝是利用95%乙醇夾帶劑濃度，粉碎粒度40目、提取時間1.5 h、采用10 mL·min-1夾帶劑流速進行超臨界萃取[18]。

紀莎等用正交試驗優化了黃芪中黃芪甲苷超臨界CO2萃取法提取工藝[19]，以黃芪甲苷得率為考察指標，用超臨界CO2萃取法提取黃芪甲苷，考察了萃取壓力、溫度、時間、萃取劑流速這幾種影響因素。結果表明，超臨界CO2萃取法提取黃芪甲苷的最佳工藝條件是:在45 ℃萃取溫度、45 MPa萃取壓力、萃取劑流速選擇20 L·h-1，經過2 h萃取。

2.3 發酵法

隨著中藥發酵技術的不斷開展，大量學者運用發酵技術以實現中藥有效成分的釋放，這不僅能提高中藥有效成分的釋放量，還可通過微生物對中藥的纖維、糖類、蛋白質等成分進行利用和轉化，產生包含多種活性成分的制劑或新藥[20]。中藥發酵借助于酶和微生物的作用，在一定的環境條件下(如溫度、濕度、空氣、水分等)，使藥物通過發酵過程，改變其原有性能，增強或產生新的功效。

侯美如等利用紫外分光光度法，測定了水浸法、水煎法兩種提取方法對黃芪與發酵黃芪中總皂苷的提取量[21]。研究結果表明發酵黃芪經水浸法、水煎法提取的總皂苷量顯著高于對照黃芪的提取量，可能是皂苷熱穩定性較差，經長時間高溫處理使皂苷受損，從而導致含量下降。同時發現黃芪經產纖維素酶解淀粉芽孢桿菌發酵后，降解了中草藥細胞壁的組成成分，如木質素和纖維素等，使得包裹在細胞壁內活性成分能夠釋放，進而提高黃芪總皂苷的含量。中藥發酵不再需要化學提取劑，因而工藝簡單、成本低，也是優勢之一。

3 常用黃芪甲苷純化方法探討

熱提產物通常用萃取來進行純化，然而萃取法所用溶劑耗費量大，富集效果差。為此不少研究者進行了純化方法的探討。其中使用多、效果相對較好的有大孔吸附樹脂純化法和堿化處理法。

3.1 大孔吸附樹脂純化法

有研究表明，通過大孔吸附樹脂處理，可以提高黃芪甲苷的純度。蔣思德等利用3種樹脂對黃芪皂苷進行了吸附和解吸實驗[22]，發現最適合黃芪皂苷純化的是D101樹脂，最佳條件下黃芪甲苷能達到93.21%的轉移率。而馮俊選擇75%乙醇作為醇提試劑，之后利用大孔樹脂吸附法純化黃芪皂苷，也發現D101樹脂由于解析率高，適合黃芪提純皂苷。

葛慷艷等利用甲醇回流提取黃芪甲苷，水溶液用水飽和的正丁醇萃取，合并正丁醇液后用氨試液洗滌，之后用丁醇飽和的水萃取，比較了高效液相色譜—紫外檢測法與CAMG薄層掃描法對黃芪甲苷含量的測定[23]。由于前者僅在200 nm處有弱的末端吸收，噪音對結果影響較大，結果重現性差。而薄層掃描法重現性好，不受紫外下無吸收成分的影響，相對來說是較好的一種黃芪甲苷含量測定方法。同時對樣品制備方法進行了改進，對照使用D101大孔樹脂進行分離，發現不用樹脂進行分離時，黃芪甲苷含量要高出10%左右，使用大孔樹脂進行分離可能會導致一部分黃芪甲苷損失。

章詩迪對大孔樹脂洗脫梯度進行優化實驗時，發現用大孔樹脂富集黃芪甲苷時，最佳洗脫條件為純水、30%乙醇水溶液依次除雜，并用70%乙醇水溶液富集[24]。

3.2 堿化處理法

楊曉雷等研究了從黃芪生藥中提取黃芪甲苷的新工藝[25]，采用黃芪生藥和提取液比為1∶12的5% NaOH溶液加熱回流提取，經HPD300大孔樹脂柱去除雜質，再用正丁醇萃取，黃芪甲苷得率高于傳統工藝，操作簡單，純度較高。

楊長花等發現黃芪藥材產地、質量不同，測定黃芪甲苷含量，各不相同。總體來看，堿化處理后黃芪甲苷含量明顯高于未用堿處理的[26]。她們比較了4個主要黃芪產地黃芪質量，利用冷浸法測定水溶性浸出物和醇溶性浸出物，應用高效液相色譜法測定黃芪甲苷的含量，結果表明，4個主要黃芪產地黃芪的水溶性浸出物含量均比醇溶性浸出物含量高。其中黃芪甲苷含量測定結果顯示，內蒙古出產的黃芪質量最為優質，其次是甘肅、山西和黑龍江出產的黃芪。

也有研究人員對黃芪甲苷提取時減少雜質的干擾進行了研究。韓鳳波發現用NaOH調節pH至11，經過75%堿性乙醇堿化處理后，能促進黃芪皂苷向黃芪甲苷轉化[27]。用甲醇洗滌進行黃芪甲苷純化，工藝簡單，減小了黃酮類、蛋白質、多糖等雜質對于黃芪甲苷制備的干擾。

由于黃芪甲苷為水溶性物質，在黃芪復方制劑中黃芪甲苷易與組分中其他成分極性近似、理化性質相近的水溶性成分互相干擾，不易進行質量控制。而不少含黃芪新藥的質量標準[1,28]中，柱層析分離純化樣品仍需要在采用索氏提取、正丁醇萃取等操作后使用，導致操作繁復，無法對一些復雜的復方制劑進行分離測定。為解決該問題，張玲等人采用甲醇回流，再用水飽和正丁醇提取黃芪甲苷，而正丁醇提取液用堿洗后經水洗到中性以便除去雜質[29]。采用雙波長薄層掃描法，分析了5種以黃芪為主藥的中成藥中黃芪甲苷的含量，該提取方法不需要上柱分離，就能有效除去雜質，方法簡便快捷，具有比較好的準確度和精密度，適用于黃芪制劑的質量控制。

夏廣萍等進一步利用不同處理方法對黃芪甲苷含量影響進行了實驗[30]，結果發現，采用氫氧化鈉溶液處理的大孔吸附樹脂法，其結果與藥典法中索氏提取法所測的含量之間無明顯差異，而使用氫氧化鉀甲醇溶液皂化，經加熱回流處理后的黃芪甲苷含量最高，與前面兩種方法相比，測量結果差異較大。

張金紅等采用正交實驗，利用堿水解法顯著提高了黃芪中黃芪甲苷收率[31]。以黃芪甲苷的收率為考察指標,優選黃芪甲苷的提取工藝。發現對黃芪甲苷的收率起主要作用的是NaOH溶液濃度,最佳工藝條件為選用0.100 mol·L-1NaOH溶液,室溫水解2 h,黃芪與堿溶液料液比為1∶12,結果顯示，經堿水解法的黃芪甲苷含量大約是未經堿處理對照組的16.4倍。該方法簡便易行,為工業化生產提供了依據。

章詩迪對提取液pH條件進行了優化，發現雖然pH值為13時提取出的黃芪甲苷含量最高，但由于配制堿液所用氫氧化鈉為雜質，在工業生產中盡可能除去，而pH為12時的黃芪甲苷純度與pH為13的結果接近，為節約除雜成本，生產中建議采用pH值為12[24]。

4 小結

目前黃芪甲苷傳統提取方法存在的問題是黃芪甲苷得率低、缺少優化工藝導致黃芪甲苷純度低、得率偏低，可以采取提取后再進一步純化的方法提高黃芪甲苷的純度。也有的提取過程繁雜、藥材浪費多，而且黃酮、多糖等成分對于黃芪甲苷提取有一定的影響，可以采用堿化處理后，用甲醇洗滌進行黃芪甲苷純化，減小黃酮類、蛋白質、多糖等雜質對于黃芪甲苷制備的干擾。正丁醇萃取處理可以提高純度，但是正丁醇沸點高，溶劑回收難。可以采用甲醇回流，再用水飽和正丁醇提取黃芪甲苷，而正丁醇提取液用堿洗后經水洗到中性以便除去雜質。雖然超臨界流體萃取提取率比一般提取方法高，但是因為其儀器設備本身造價高，使用、維護費用也較高，實現工業化生產還需進一步提升工藝方法。黃芪發酵無須化學提取劑，工藝簡單，成本低，有的研究試驗采用解淀粉芽孢桿菌作為發酵菌種，安全性較好。總體來說，應根據黃芪種類及其有效活性成分性質的不同，選擇合適的提取工藝來提高黃芪甲苷含量。