氨基寡糖素對苦瓜枯萎病的抗性誘導作用

2022-02-08 12:09:10黃熊娟黃如葵馮誠誠琚茜茜梁家作陳振東黃玉輝陳小鳳劉杏連

西南農業(yè)學報 2022年11期

黃熊娟，黃如葵，馮誠誠，琚茜茜，秦健，梁家作，陳振東，黃玉輝，陳小鳳，劉杏連

(廣西農業(yè)科學院蔬菜研究所/廣西蔬菜育種與新技術研究重點實驗室，南寧 530007)

【研究意義】苦瓜是我國重要的特色瓜類蔬菜，在其產業(yè)快速發(fā)展的同時，連作障礙問題也日益突出。其中，苦瓜枯萎病發(fā)病率已呈直線上升趨勢，且重病區(qū)的發(fā)病率在85%以上，經濟損失慘重。此外，苦瓜科研中的種質資源和中間材料因枯萎病而大量死亡，對苦瓜種質資源保存、創(chuàng)新及新品種選育也造成嚴重影響。目前，對枯萎病的防御策略主要是從耕作制度和種植方式優(yōu)化、抗病品種和嫁接砧木篩選利用、土壤消毒和土壤管理、栽培管理及化學防治和生物防治等角度著手。誘導抗病技術是一種安全有效的植物病害防治技術，可通過誘抗劑刺激植物免疫系統(tǒng)產生廣譜、持久的抗病性能，其中的氨基寡糖素(一種植物免疫誘抗劑類新型生物農藥[1])對各種果樹、蔬菜和作物的真菌、細菌和病毒均具有一定的防治效果[2-5]，但其對苦瓜枯萎病的抗性誘導效果尚不清楚。因此，探究氨基寡糖素誘導苦瓜幼苗抗枯萎病發(fā)生的方式及誘導抗病性對苦瓜組織結構、次生代謝物質和病程相關蛋白活性變化情況的影響，對完善氨基寡糖素誘導苦瓜抗枯萎病技術具有重要意義。【前人研究進展】與傳統(tǒng)殺菌劑相比，植物誘抗劑具有微量、廣譜、持效期長、不易產生抗藥性及對環(huán)境友好等特點。已有研究發(fā)現(xiàn)，寡糖、聚糖類和苯并噻二唑類等有機化合物類誘抗劑對多種真菌病害的抗性誘導具有較好效果[6-9]。在土傳病害抗性誘導中，莊敬華等[10]研究認為，0.1和0.5 mol/L水楊酸及4.0 mol/L草酸處理土壤對甜瓜枯萎病的誘抗有效；石延霞等[11-12]利用氟唑活化酯胚根浸種結合葉面噴霧、吡唑并嘧啶衍生物葉面噴施誘導黃瓜抗枯萎病，均獲得較好的誘導抗病效果；袁新琳等[13]研究認為，氨基寡糖素可有效誘導棉花抗枯萎病和黃萎病。植物次生代謝產物主要包括木質素、胼胝質和酚類化合物等，而病原物侵襲可誘導植物產生大量可溶性酚類物質，抑制病原物遷移和擴增[14]，細胞壁上的大量酚類物質也與植物的抗病性密切相關[15]，在病原菌侵染產生過敏性反應過程中，植物細胞中的木質素、胼胝質和酚類物質等細胞結構及植物組織木質化程度均有所增強，能阻止病原菌從植物細胞汲取營養(yǎng)和水分，抵御病原菌侵染[16]。已有研究表明，在寄主植物和病原物抗病反應及親和性互作的感病反應中，過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等植物體內較重要的保護酶和防御酶與植物抗性密切相關[16-18]。【本研究切入點】至今，關于氨基寡糖素誘導苦瓜枯萎病抗性的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】以不同濃度誘抗劑氨基寡糖素對苦瓜幼苗進行噴霧和灌根處理，誘導苦瓜對外來病原菌產生免疫反應從而獲得對枯萎病的抗性，實現(xiàn)抵御枯萎病能力的提升，為完善氨基寡糖素誘導苦瓜抗枯萎病技術及促進苦瓜產業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年7—10月在廣西農業(yè)科學院蔬菜所院科研基地進行。供試誘抗劑為5%氨基寡糖素(海南正業(yè)中農高科股份有限公司，水劑)，對照誘抗劑為0.5%幾丁聚糖(成都特普科技發(fā)展有限公司，水劑)和6%低聚糖素(海南正業(yè)中農高科股份有限公司，水劑)；供試苦瓜品種桂農科三號由廣西農業(yè)科學院蔬菜研究所選育提供；供試病原菌尖孢鐮刀菌苦瓜專化型(Fusariumoxysporumf. sp.Momordicae，F(xiàn)OM)由廣西農業(yè)科學院蔬菜研究所保存提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘導方式葉面噴霧誘導：配制5%氨基寡糖素1500倍液(Y-3處理)，于苦瓜2葉1心期首次噴施，每隔3 d噴施1次，共噴3次，3次重復，每重復40株；對照誘抗劑為0.5%幾丁聚糖300倍液(Y-1處理)和6.0%低聚糖素800倍液(Y-2處理)，以噴霧清水為空白對照(CK1)。使用微量噴霧系統(tǒng)將藥液均勻噴施于苦瓜葉面，噴霧量為200 μL/株。誘導24 h后用1×106個/mLFOM孢子懸浮液灌根接種。在接種后第15天調查苦瓜枯萎病發(fā)病情況及誘抗效果。

灌根誘導：配制5%氨基寡糖素1000倍液(G-3處理)，于苦瓜2葉1心期首次灌根，每株灌根50 mL，每隔3 d灌根1次，共灌3次，3次重復，每重復40株；對照誘抗劑為0.5%幾丁聚糖100倍液(G-1處理)和6%低聚糖素600倍液(G-2處理)，以清水灌根為空白對照(CK2)。誘導24 h后用1×106個/mLFOM孢子懸浮液灌根接種。在接種后第15天調查苦瓜枯萎病發(fā)病情況及誘抗效果。

1.2.2 最佳誘導濃度篩選采用灌根誘導方式，設5%氨基寡糖素800倍液(NG1-1)、1000倍液(NG1-2)和1500倍液(NG1-3)3個濃度處理，以清水灌根為對照(NG1-CK)，3次重復，每重復40株，篩選5%氨基寡糖素灌根的最佳濃度，并以此濃度開展1.2.4和1.2.5試驗。

1.2.3 枯萎病病情分級及誘抗效果評價參考陳振東等[19]的方法進行苦瓜枯萎病病情分級。無病癥為0級；子葉發(fā)黃為1級，子葉變黃且邊緣皺縮，但真葉正常為3級；子葉皺縮枯死、部分真葉發(fā)黃為5級；真葉發(fā)黃、部分葉片黃化或停止生長為7級；全株葉片黃化萎蔫或枯死為9級。病情指數(shù)(DI)為0表示免疫，0.01≤病情指數(shù)<15.00表示高抗(HR)，15.00≤病情指數(shù)<35.00表示抗病(R)，35.00≤病情指數(shù)<55.00表示中抗(MR)，55.00≤病情指數(shù)<75.00表示感病(S)，75.00≤病情指數(shù)<100.00表示高感(HS)。誘導抗病指數(shù)越高，表示誘導效果越好。

病情指數(shù)=∑(病株數(shù)×該級代表值)/(總株數(shù)×最高級代表值)×100

誘導抗病指數(shù)=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100

1.2.4 氨基寡糖素誘導對苦瓜病程相關蛋白酶活性的影響配制5%氨基寡糖素1000倍液對苦瓜幼苗進行灌根誘導(參照1.2.1中的灌根誘導方法)，分別設誘導不接種(T1)、誘導后接種(T2)、未誘導只接種(T3)和未誘導未接種(T4)4個處理，每處理50株。各處理苦瓜幼苗分別于誘導接種后0、1、2、4、6和8 d取苦瓜根部，參考蘇州科銘生物技術有限公司生產的PAL試劑盒、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-GLU)試劑盒、POD試劑盒和PPO試劑盒說明分別進行PAL、β-1,3-GA、POD和PPO活性測定。

1.2.5 氨基寡糖素誘導對枯萎病菌侵染苦瓜的影響配制5%氨基寡糖素1000倍液(JG1)進行灌根誘導(參照1.2.1中的灌根誘導方法)，設未誘導只接種為對照(JG-CK)。接種后0、2、4、6、8、10、14、18、22和26 d分別取苦瓜根組織備用。每處理50株，對照50株。采用酸性品紅染色法對苦瓜根系進行處理，處理后取出放入培養(yǎng)皿中，用不加酸性復紅的乳酸液脫色30 min，置于TO型生物制片透明劑中透明2 min，在Olympus BX51顯微鏡下觀察菌絲侵染情況[20]。

1.2.6 氨基寡糖素誘導對苦瓜次生代謝物質的影響配制5%氨基寡糖素1000倍液進行灌根誘導處理(參照1.2.1中的灌根誘導方法)，觀察苦瓜根、莖、葉的木質素、酚類化合物和胼胝質變化情況。分別設誘導不接種(J1)、誘導后接種(J2)、未誘導只接種(J3)和未誘導未接種(J4)4個處理，每處理50株。分別于接種后0、1、2、4、6和8 d取苦瓜+1葉和+2葉(中部葉片)、根(距土表0.5 cm處)和莖(距土表0.5 cm處)，將根莖處理成厚1.0 mm的薄片(橫切面)，葉片處理成4.0 mm葉盤，放入冰醋酸和95%酒精混合液(1∶1)中，固定24 h后置于飽和水合氯醛水溶液中，抽氣去氣泡靜置60 d，待植物組織透明后浸泡于無水乙醇中48 h，用蒸餾水清洗3次后備用。

采用Maule反應方法測定誘導后苦瓜木質素的沉積量，將透明過的根、莖、葉組織塊浸于1%(W/V)KMnO4溶液中15 min，水沖洗2次，再浸于2%(W/V)HCl中5 min，水沖洗后用4.0 mol/L NH4Cl溶液制片，在Olympus BX51顯微鏡下觀察熒光情況。

采用甲苯胺藍染色法測定誘導后苦瓜的酚類化合物含量，將透明過的根、莖、葉組織塊浸于 0.05%甲苯胺藍(溶于 0.05 mol/L檸檬酸緩沖液，pH 3.0)中 10 min，在相同溶液中制片，在 Olympus BX51顯微鏡下觀察熒光情況，并測定各組織的熒光平均強度。

采用苯胺藍染色法測定誘導后苦瓜的胼胝質含量，在透明過的根、莖、葉組織塊上滴 5～10 滴 0.5%(W/V)苯胺藍(溶于50%乙醇中)染色 4～8 h，50%乙醇(新配制)中沖洗制片，在 Olympus BX51顯微鏡下觀察熒光情況，并測定各組織的熒光平均強度。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007、DPSV 15.10和網頁版ImageJ.JS(https://cnij.imjoy.io/)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 5%氨基寡糖素葉面噴霧和灌根處理對苦瓜幼苗枯萎病抗性的影響

由表1可知，苦瓜幼苗葉面噴霧Y-1、Y-2和Y-3誘導接種15 d后，其枯萎病病株率分別為82.35%、94.44%和52.63%，其中，Y-1和Y-3處理分別較CK1降低5.15%和34.87%(絕對值，下同)，Y-2處理較CK1提高6.94%；Y-1、Y-2和Y-3處理的苦瓜病情指數(shù)分別為54.90、62.34和30.83，其中，Y-1和Y-2處理的病情指數(shù)分別較CK1提高0.73和8.17，Y-3處理的病情指數(shù)較CK1降低23.34；Y-1、Y-2和Y-3處理的誘導抗病指數(shù)分別為-1.34、-15.08和43.09，其中，Y-3處理的誘導抗病指數(shù)極顯著高于Y-1和Y-2處理(P<0.01，下同)，Y-1處理與Y-2處理的誘導抗病指數(shù)差異不顯著(P>0.05，下同)。說明5%氨基寡糖素1500倍液噴霧對苦瓜幼苗枯萎病抗性的誘導效果明顯優(yōu)于噴施0.5%幾丁聚糖300倍液和6.0%低聚糖素800倍液。

表1 誘導劑葉面噴霧和灌根處理對苦瓜幼苗枯萎病的抗性誘導效果

從表1可看出，苦瓜幼苗灌根G-1、G-2和G-3誘導接種15 d后，其枯萎病病株率分別為93.75%、91.67%和50.00%，分別較CK2降低6.25%、8.33%和50.00%；G-1、G-2和G-3處理的病情指數(shù)分別為75.69、87.96和25.00，其中，G-1和G-3處理分別較CK2降低8.75和59.44，G-2處理較CK2提高3.52；G-1、G-2和G-3處理的誘導抗病指數(shù)分別為10.36、-4.16和70.39，其中，G-3處理的誘導抗病指數(shù)極顯著高于G-1和G-2處理，G-1處理顯著高于G-2處理(P<0.05，下同)。說明5%氨基寡糖素1000倍液灌根對苦瓜幼苗枯萎病抗性的誘導效果優(yōu)于0.5%幾丁聚糖100倍液和6.0%低聚糖素600倍液灌根。

2種枯萎病抗性誘導方式的最佳誘導效果比較結果表明，5%氨基寡糖素1000倍液灌根對苦瓜幼苗枯萎病抗性的誘導抗病指數(shù)(70.39)較5%氨基寡糖素1500倍液噴霧的誘導抗病指數(shù)(40.09)高27.30。因此，下一步以氨基寡糖素灌根誘導方式開展誘導濃度篩選試驗。

2.2 5%氨基寡糖素灌根誘導苦瓜幼苗枯萎病抗性的濃度篩選結果

前期試驗結果表明，以5%氨基寡糖素進行灌根較葉面噴霧更適合苦瓜苗期枯萎病抗性誘導，因此，進一步開展氨基寡糖素灌根誘導濃度篩選試驗。由表2可知，苦瓜幼苗灌根NG1-1、NG1-2和NG1-3誘導接種15 d后，其枯萎病病株率分別為50.00%、37.50%和50.00%，分別較NG1-CK降低50.00%、62.50%和50.00%；病情指數(shù)分別為27.22、19.44和26.11，分別較NG1-CK降低64.59、72.37和65.70；誘導抗病指數(shù)分別為70.35、73.24和71.56，其中，NG1-2處理的誘導抗病指數(shù)最高，但三者間無顯著差異。說明5%氨基寡糖素800倍液、1000倍液和1500倍液灌根對苦瓜枯萎病均具有較好的誘抗效果，且抗性均達抗病(R)水平，其中1000倍液的誘導抗病效果最佳。因此，以5%氨基寡糖素1000倍液灌根進一步開展其他試驗。

表2 不同濃度5%氨基寡糖素對苦瓜幼苗枯萎病的抗性誘導效果比較

2.3 5%氨基寡糖素對苦瓜根系病程相關蛋白酶活性的影響

2.3.1 對PPO活性的影響從圖1-A可看出，T1、T2和T3處理的PPO活性在誘導或接種后迅速升高，處理1 d即達峰值，以T2處理的峰值明顯高于其他處理，隨后3個處理的PPO活性均開始逐漸下降，至處理第6天又開始上升，處理第8天達第二峰值，但3個處理間差異較小；而T4處理的PPO活性在處理后1 d升幅較小，且在處理1 d后均均處于降低狀態(tài)。可見，5%氨基寡糖素誘導和接種均可提高苦瓜幼苗根系組織的PPO活性，并維持在較高水平，有利于提高苦瓜幼苗抵抗枯萎病侵染的能力，尤其以誘導后接種(T2處理)的效果更佳。

2.3.2 對PAL活性的影響從圖1-B可看出，T2處理的PAL活性在處理后1 d達峰值，之后活性緩慢降低，在處理第2天又緩慢升高，并保持在較平穩(wěn)的高水平；T1處理的PAL活性在處理后1 d達峰值，隨后快速降低，處理第2天快速升高，并在處理第4天達第二峰值，隨后呈降低趨勢；T3處理的PAL活性分別在處理的第1天和第6天出現(xiàn)2個峰值，但升高幅度不大；T4處理的PAL活性在處理后呈波動降低趨勢。說明5%氨基寡糖素誘導和接種均可提高苦瓜根系組織的PAL活性，并維持在較高水平，有利于提高苦瓜幼苗抵抗枯萎病侵染的能力，尤其以誘導后接種(T2處理)的效果更佳。

2.3.3 對POD活性的影響從圖1-C可看出，T1、T2和T3處理的POD活性變化趨勢一致，均在處理后迅速升高，處理第2天達峰值，隨后活性急劇下降，在處理第4天活性降至谷底后又迅速升高，處理第8天達第二峰值，2個峰值均以T2處理最高；T4處理的POD活性變化較平緩，無明顯的升降變化。說明5%氨基寡糖素誘導和接種均可迅速提高苦瓜根系組織的POD活性，有利于提高苦瓜幼苗抵抗枯萎病侵染的能力，尤其以誘導后接種(T2處理)的效果更佳。

2.3.4 對β-1,3-GLU活性的影響圖1-D表明，T2處理的β-1,3-GLU活性在處理后快速升高，并在處理的第1天達峰值，隨后活性開始下降，處理的第2天降至T4處理水平，之后活性上升，在處理的第6天達第二峰值；T1處理的β-1,3-GLU活性在處理后快速升高，在處理的第1天達峰值，隨后活性開始下降，在處理2 d后又繼續(xù)升高，在處理的第6天達第二峰值，且該峰值明顯高于其他處理；T3處理的β-1,3-GLU活性變化趨勢與T2處理相似，但活性整體較T2處理低；T4處理β-1,3-GLU活性的升降變化平緩。說明5%氨基寡糖素誘導和接種均可迅速提高苦瓜根系組織的β-1,3-GLU活性，有利于提高破壞真菌細胞壁能力，從而提高抵抗枯萎病能力。

A、B、C、D分別代表PPO、PAL、POD、β-1,3-GLU活性A，B，C and D represented activities of PPO，PAL，POD and β-1,3-GLU，respectively 圖1 5%氨基寡糖素誘導接種后苦瓜幼苗PPO、PAL、POD和GLU活性的變化情況Fig.1 Activity changes of PPO，PAL，POD and GLU in bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

2.4 5%氨基寡糖素誘導對枯萎病菌侵染苦瓜的影響

經顯微觀察，經5%氨基寡糖素誘導接種后6 d，苦瓜根系中開始有枯萎病菌侵染(圖2-A)，接種后6～14 d根系中觀察到少量菌絲，接種后18 d出現(xiàn)大量菌絲(圖2-B)，接種后22 d開始出現(xiàn)孢子(圖2-C)，接種后24 d產生大量孢子；而對照(JG-CK)在接種后2 d即發(fā)現(xiàn)有菌絲產生(圖2-D)，接種后8 d出現(xiàn)大量菌絲并產生孢子(圖2-E)，接種后14 d產生大量孢子(圖2-F)。可見，5%氨基寡糖素誘導不能阻止苦瓜枯萎病菌菌絲對根系的侵染，但可延緩枯萎病菌的侵染時間，同時可阻止菌絲進一步發(fā)展和抑制孢子形成。

2.5 5%氨基寡糖素誘導對苦瓜次生代謝物質的影響

2.5.1 對苦瓜木質素沉積的影響在5%氨基寡糖素誘導后接種0 d取樣發(fā)現(xiàn)，J1或J2處理苦瓜幼苗的根、莖和葉片中均出現(xiàn)木質素沉積現(xiàn)象，根細胞組織(圖3-A)、莖組織的韌皮部和木質部(圖3-B)及葉面細胞壁(圖3-C)均出現(xiàn)木質素沉積，但J1處理與J2處理差異不明顯；隨著處理時間的延長，根、莖和葉片中木質素沉積量明顯增加，J1或J2處理的木質素沉積量在根組織的細胞壁(圖3-D)、莖組織的細胞壁和韌皮部(圖3-E)及葉片的大葉脈和細胞壁(圖3-F)沉積明顯。說明經5%氨基寡糖素誘導后的苦瓜組織均存在不同程度的木質素沉積現(xiàn)象。

2.5.2 對苦瓜酚類化合物代謝變化的影響從圖4～5可看出，在J1或J2處理的根組織中，接種后0 d開始出現(xiàn)熒光信號(圖4-A)，有酚類物質沉積(圖5-A)，隨后平均熒光強度呈上升趨勢，接種后2和6 d平均熒光強度分別達峰值，酚類物質沉積量較大(圖5-B)，接種后8 d平均熒光強度降低，酚類物質沉積減少(圖5-C)；而在J3和J4處理的根系組織中，接種后0 d出現(xiàn)微弱熒光信號(圖4-A)，J3處理在接種后1 d平均熒光強度達峰值，隨后緩慢下降，J4處理在接種后2和8 d平均熒光強度分別達峰值，但整體波動不大，熒光信號不強。在J1或J2處理的莖組織中，接種后0 d無明顯熒光信號(圖4-B)，有少量酚類物質沉積(圖5-D)，接種后1 d開始出現(xiàn)熒光信號，有酚類物質沉積(圖5-E)，隨后熒光信號迅速增強，平均熒光強度在接種后4 d達峰值，酚類物質沉積量較大(圖5-F)，接種后6 d熒光信號減弱，接種后8 d信號繼續(xù)增強，其中J2處理的平均熒光強度出現(xiàn)第二峰值；而在J3和J4處理的莖組織中，接種后0 d無明顯熒光信號(圖4-B)，隨后平均熒光強度緩慢增強，J3處理在接種后4 d出現(xiàn)峰值，J4處理在接種后6 d出現(xiàn)峰值，但熒光強度均不強。在J1或J2處理的葉組織中，接種后0 d開始出現(xiàn)熒光信號(圖4-C)，有酚類物質沉積(圖5-G)，接種后4 d熒光信號最強，酚類物質沉積量較大(圖5-H)，隨后熒光信號減弱，至接種后8 d熒光信號繼續(xù)減弱，酚類無明顯沉積(圖5-I)。說明經5%氨基寡糖素誘導后，苦瓜幼苗根、莖和葉片中均出現(xiàn)不同程度的酚類化合物沉積現(xiàn)象。

A、B、C分別代表氨基寡糖素誘導接種后6、18和22 d苦瓜幼苗根系受枯萎病菌侵染情況；D、E、F分別代表對照接種后2、8和14 d苦瓜幼苗根系受枯萎病菌侵染情況；M代表菌絲；S代表孢子A，B and C represented the wilt pathogen infection status of bitter gourd seedlings induced and inoculated with amino-oligosaccharide on 6，18 and 22 days，respectively；D，E and F represented the wilt pathogen infection status of bitter gourd seedlings in the control on 2，8 and 14 days of inoculation；M represented mycelium；S represented spore圖2 5%氨基寡糖素誘導接種后苦瓜幼苗根系枯萎病菌的侵染情況Fig.2 Wilt pathogen infection status in bitter gourd roots after being induced and inoculated by 5% amino-oligosaccharides

A、D分別代表誘導接種后0和8 d J1處理根系木質素的沉積情況；B、E分別代表誘導接種后0和8 d J2處理莖木質素的沉積情況；C、F分別代表誘導接種后0和6 d J1處理葉片木質素的沉積情況A and D represented root lignin deposition on 0 and 8 days of J1 treatment after induction and inoculation，respectively；B and E represented stem lignin deposition on 0 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation；C and F represented leaf lignin deposition on 0 and 6 days of J1 treatment after induction and inoculation圖3 5%氨基寡糖素誘導接種后苦瓜幼苗根、莖和葉木質素的沉積情況Fig.3 The dynamic changes of lignin in root，stem and leaf of bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

A、B、C分別代表根、莖和葉組織酚類化合物的平均熒光強度A，B and C represented the mean gray value change of phenolic compounds in root，stem and leaf，respectively 圖4 5%氨基寡糖素誘導接種后苦瓜幼苗酚類化合物平均熒光強度的變化情況Fig.4 Mean gray value changes of phenolic compounds in bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

A、B、C代表誘導接種后0、6和8 d J2處理根系酚類化合物的沉積情況；D、E、F代表誘導接種后0、1和8 d J2處理莖酚類化合物的沉積情況；G、H、I代表誘導接種后0、4和8 d J2處理葉片酚類化合物的沉積情況A，B and C represented root phenolic compound deposition on 0，6 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation；D，E and F represented stem phenolic compound deposition on 0,1 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation；G，H and I represented leaf phenolic compound deposition on 0, 4 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation圖5 5%氨基寡糖素誘導接種后苦瓜幼苗根、莖和葉酚類化合物的沉積情況Fig.5 Phenolic compound deposition in root，stem and leaf of bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

2.5.3 誘導后苦瓜胼胝質的變化從圖6～7可看出，在J1或J2處理的根組織中，接種后0 d出現(xiàn)熒光信號(圖6-A)，隨后平均熒光強度呈上升趨勢，接種后4 d平均熒光強度達峰值，胼胝質沉積量較大，隨后熒光信號和平均熒光強度減弱(圖7-A)；而在J3和J4處理的根系組織中，接種后0 d出現(xiàn)微弱熒光信號(圖6-A)，其中，J3處理隨后呈緩慢上升趨勢，接種后4 d達峰值，隨后急劇下降，而J4處理的熒光信號波動相對平緩，熒光強度處于較低水平(圖7-A)。在J1或J2處理的莖組織中，接種后0 d有微弱熒光信號(圖6-B)，接種后1 d到第一峰值，但平均熒光強度較低，隨后呈下降趨勢，胼胝質沉積不明顯，接種后4 d后熒光信號迅速增強，平均熒光強度在接種后8 d達峰值，胼胝質沉積量較大(圖7-B)；而在J3和J4處理的莖組織中，接種后0 d無明顯熒光信號(圖6-B)，隨后平均熒光強度增強，但整體波動不大，熒光強度均不高(圖7-B)。在J1或J2處理的葉組織中，接種后0 d開始出現(xiàn)熒光信號(圖6-C)，有胼胝質沉積，接種后6 d J1處理的熒光信號最強，胼胝質沉積量較大(圖7-C)，隨后熒光信號減弱，接種后8 d熒光信號不明顯，胼胝質無明顯沉積，而J2處理在接種后2 d熒光信號最強(圖6-C)，胼胝質沉積量較大，隨后熒光信號減弱，接種后8 d熒光信號不明顯，胼胝質無明顯沉積(圖7-C)。說明經5%氨基寡糖素誘導后，苦瓜幼苗根、莖和葉片中均出現(xiàn)不同程度的胼胝質沉積現(xiàn)象。

3 討論

氨基寡糖素作為一種新型植物免疫誘抗劑在抗病誘導方面具有較好效果，已受到越來越多研究者的關注。已有研究表明，氨基寡糖素可誘導棉花抗枯黃萎病[13]、番茄抗早疫病[21]、香蕉抗褐緣灰斑病[22]和火龍果抗?jié)儾23]。檀志全等[24]研究發(fā)現(xiàn)，5%氨基寡糖素對葡萄霜霉病的預防效果為78.29%，對葡萄炭疽病的預防效果為60.00%。李育林[25]研究發(fā)現(xiàn)，噴施3%氨基寡糖素250倍液對葡萄霜霉病的防效達74.73%。本研究結果表明，5%氨基寡糖素1000倍液灌根可有效誘導苦瓜對枯萎病的抗性，誘導接種后的苦瓜枯萎病病情指數(shù)降低59.44，對枯萎病的抗性達抗病(R)水平，誘導抗病指數(shù)為70.39，與上述研究結果相似。

A、B、C分別代表根、莖和葉組織胼胝質的平均熒光強度A，B and C represented the mean gray value change of callose in root，stem and leaf，respectively 圖6 5%氨基寡糖素誘導接種后苦瓜幼苗胼胝質的平均熒光強度的變化情況Fig.6 Mean gray value changes of callose in bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

A代表誘導接種后6 d J2處理根系的胼胝質沉積情況；B代表誘導接種后2 d J1處理莖的胼胝質沉積情況；C代表誘導接種后6 d J1處理葉片的胼胝質沉積情況A represented root callose deposition on 6 days of J2 treatment after induction and inoculation；B represented stem callose deposition on 2 days of J1 treatment after induction and inoculation；C represented leaf callose deposition on 6 days of J1 treatment after induction and inoculation圖7 5%氨基寡糖素誘導接種后苦瓜幼苗根、莖和葉胼胝質的沉積情況Fig.7 Callose deposition in root, stem and leaf of bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

在病原菌侵染過程中，寄主植物為抵抗病原菌侵染會啟動自身的免疫系統(tǒng)，促進細胞壁次生代謝物質活性提高及植保素和病程相關蛋白合成等誘導抗病性反應。苯丙烷代謝途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一，由這一途徑產生的次生物質木質素和酚類物質在植物生長發(fā)育、抵御病蟲害及構成植物支撐系統(tǒng)等方面具有重要意義。PAL和POD均是植物苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶，與木質素、植保素和酚類化合物等抗性物質的形成密切相關[26]。PPO可催化木質素和酚類氧化產物的形成，產生保護性屏蔽[27]。β-1,3-GLU是植物真菌病的重要抗性物質之一，通過水解β-1,3-葡聚糖破壞真菌細胞壁而導致病原真菌死亡，發(fā)揮防御病害作用[28-30]。Liu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，以苯并噻二唑(ASM)處理甜瓜，可激活甜瓜果實的內苯丙烷代謝相關酶活性及增強相關代謝物質含量，從而加強果實細胞壁和防止病原入侵。商文靜[32]研究表明，殼寡糖誘導后煙葉體內與抗病性相關的各種防御酶活性均發(fā)生不同程度變化，PAL活性在接種后大幅度升高。王杰等[33]噴施6.25 mg/L氨基寡糖素能系統(tǒng)誘導煙草POD、PAL和SOD活性，提高煙草抗病性。袁新琳等[13]研究表明，氨基寡糖素能誘導棉葉中POD、PPO和PAL活性提高。本研究中，5%氨基寡糖素誘導可有效提高苦瓜幼苗根系中的PPO、PAL和POD活性，與前人研究結果一致[13]；經過氨基寡糖素誘導接種后6 d，苦瓜根系開始有枯萎病菌侵染，接種后6～14 d根系中觀察到少量菌絲，而對照在接種后2 d即發(fā)現(xiàn)有菌絲產生，接種后8 d出現(xiàn)大量菌絲，接種后14 d有大量孢子產生，說明氨基寡糖素誘導可延緩枯萎病菌侵染時間，同時可阻止菌絲進一步發(fā)展和抑制孢子形成，與石延霞等[12]、孫輝[34]、石延霞[35]的研究結果一致，表明誘抗劑氨基寡糖素可有效誘導植物枯萎病的抗性，推測其抗性生理機理可能是通過苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶調控木質素和酚類化合物沉淀，進而直接阻礙枯萎病菌菌絲對苦瓜的侵染而增強苦瓜對枯萎病的防御能力；誘導β-1,3-GLU提高，有效延緩苦瓜枯萎病菌的擴展速度。