結(jié)直腸癌血瘀證腫瘤組織與正常組織差異表達(dá)蛋白比較

柴仲秋 周 冰 張靜莎 韓云雨

(1 天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,天津,300451; 2 天津中醫(yī)藥大學(xué),天津,301608)

近年來，中醫(yī)辨證論治在結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)治療方案中逐漸成為不可忽視的一環(huán)，其積極作用也日益顯現(xiàn)。然而由于缺乏客觀、穩(wěn)定的診斷及療效評價指標(biāo)，中醫(yī)證候的辨識多顯得模糊不穩(wěn)定。因此，探尋中醫(yī)證候標(biāo)志性因子，為中醫(yī)證候客觀化提供依據(jù)一直以來是研究的熱點和方向。課題組在前期對臨床CRC患者進(jìn)行辨證分析，發(fā)現(xiàn)血瘀證為臨床常見證候之一，因此應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)對血瘀證腫瘤組織和正常組織的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了比較和分析。

1 資料與方法

1.1 資料與材料 選取2012年8月至2019年8月因CRC就診于天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院行手術(shù)治療的患者158例進(jìn)行臨床資料采集和中醫(yī)證候調(diào)查。本研究通過倫理委員會審批(倫理審批號：201201012)。手術(shù)切除腫瘤后每例標(biāo)本分別取癌灶腸管組織及遠(yuǎn)端正常腸管組織(距腫瘤邊緣5～8 cm，具體根據(jù)截取腸管長度，選擇最遠(yuǎn)端正常組織)，各2份，立即置于液氮凍存。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照中華中醫(yī)藥學(xué)會《中醫(yī)肛腸科常見病診療指南》[1]、Dukes分期及AJCC/UICC TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情分期判定[2]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1)CRC初發(fā)患者;2)年齡<85歲的患者;3)已簽署知情同意書者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)入組前已經(jīng)接受放化療患者;2)伴有急性闌尾炎、腹膜炎等其他急腹癥癥狀的患者;3)合并嚴(yán)重的心、肝、腎、腦等臟器器質(zhì)性或功能性疾病患者;4)意識或言語表述不清的患者;5)無法判斷中醫(yī)證型及資料不全患者。

1.5 試劑與儀器 iTRAQ?試劑盒中的還原劑(AB Sciex公司，美國，貨號：4381664)、iTRAQ?試劑盒中的Cysteine-Blocking試劑(AB Sciex公司，美國，貨號：4381664)、iTRAQ?試劑盒中的解散緩沖試劑(AB Sciex公司，美國，貨號：4381664)、胰蛋白酶(AB Sciex公司，美國，貨號：4370285，4352157)，溶于解散緩沖試劑；高效液相色譜儀：[Thermo Scientic公司，美國，型號：EASY-nLC 1000 System(Nano HPLC)]、質(zhì)譜系統(tǒng)(Thermo Scientic公司，美國，型號：Q-Exactive)。

1.6 證候調(diào)查方法 結(jié)合中醫(yī)專家臨床經(jīng)驗制訂《結(jié)直腸癌中醫(yī)證候調(diào)查初表》，并請2名中醫(yī)主任醫(yī)師對該表進(jìn)行審核及修正。由2名主治醫(yī)師依照中醫(yī)證候采集表對158例患者進(jìn)行一般情況及中醫(yī)四診信息的調(diào)查。采取雙人核對錄入的方法將數(shù)據(jù)錄入Epidata 3.0流行病學(xué)軟件建立數(shù)據(jù)庫。對接受擇期手術(shù)的患者進(jìn)行詳細(xì)的術(shù)式及病理信息采集。

1.7 蛋白提取 將樣本用液氮預(yù)冷的砸碎器砸碎，液氮研磨，按照1∶10(W/V)加入裂解液{7 mmol/L尿素，2 mmol/L硫脲，4% 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate,CHAPS)}，渦旋混勻，室溫提取30 min；40 000×g，10 ℃離心1 h，小心取出上清，分裝后凍存于-80 ℃。同時進(jìn)行分組標(biāo)記。二喹啉甲酸法(Bicinchoninic Acid，BCA)法定量檢測蛋白質(zhì)水平。

1.8 蛋白酶解及標(biāo)記 蛋白定量后取200 μg蛋白溶液置于離心管中，按照iTRAQ試劑盒操作說明得到100 μL酶解后的樣品，并分別進(jìn)行標(biāo)記，腫瘤組織標(biāo)記為117，正常組織標(biāo)記為118。

1.9 酶解肽段離線預(yù)分離及液質(zhì)色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid Chromatography-mass Spectroscopy/Mass Spectrometry，LC-MS/MS質(zhì)譜分析

1.9.1 高pH條件下的反相色譜分離 用100 μL的流動相A溶解混合標(biāo)記后的樣品，使用400 μg酶解好的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)進(jìn)行分離，取100 μL準(zhǔn)備好的樣本上樣，流速0.7 mL/min分離。取100 μL準(zhǔn)備好的樣本上樣；流速0.7 mL/min梯度分離。

1.9.2 納升級反相色譜-Q-Exactive進(jìn)行蛋白質(zhì)分析 將高pH反相分離得到的組分用20 μL 12%ACN，0.1%FA復(fù)溶;12 000 r/min離心10 min，離心半徑15 cm，吸取上清上樣;上樣體積8 μL，采取夾心法上樣;Loading Pump流速3 μL/min，5 min;分離流速0.3 μL/min。設(shè)置質(zhì)譜參數(shù)后，進(jìn)行質(zhì)樸分析。

1.9.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 在本次實驗中選擇的數(shù)據(jù)庫來自美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，數(shù)據(jù)庫本版為Ref_Human_130704。iTRAQ的質(zhì)譜分析是由Thermo Q-Exactive型質(zhì)譜完成，產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件采用Thermo公司的配套商用軟件Proteome Discoverer1.3處理。

1.9.4 數(shù)據(jù)的生物信息解析 將組間的差異表達(dá)蛋白輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能和基因檢索，將對應(yīng)基因保存為TXT文件，輸入到Metascape，選擇選擇H.Sapiens，然后選擇Express Analysis，可自動生成對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行的通路富集和分析。

2 結(jié)果

2.1 證候調(diào)查結(jié)果 證候診斷為血瘀證的患者共24例，男13例，女11例，平均年齡為(58.43±16.05)歲；TNM分期：Ⅰ期15例、Ⅱ期6例、Ⅲ期3例；病理大體分型：隆起型6例、潰瘍型13例、浸潤型5例；病理類型：腺癌19例、黏液腺癌2例、印戒細(xì)胞癌2例、腺癌并印戒細(xì)胞癌1例。

2.2 差異表達(dá)蛋白識別 根據(jù)蛋白定量信息，選取上下調(diào)差異倍數(shù)≥1.4的蛋白作為差異蛋白結(jié)果。在血瘀證組織比較中，腫瘤組織較遠(yuǎn)端正常組織差異蛋白共55個，其中上調(diào)13個。見表1。下調(diào)42個。見表2。

表1 血瘀證腫瘤組織與正常組織比較

表2 血瘀證腫瘤組織與正常組織比較

續(xù)表2 血瘀證腫瘤組織與正常組織比較

2.3 差異表達(dá)蛋白分析 應(yīng)用Metascape對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行通路富集顯示，差異表達(dá)蛋白多集中在紅細(xì)胞吸收氧氣并釋放二氧化碳、超分子纖維組織、表皮細(xì)胞分化、核心組織、NABA核心母體、對無機物的反應(yīng)、Nop56p相關(guān)前rRNA復(fù)合體、中性粒細(xì)胞遷移、DNA結(jié)合的調(diào)控、水解酶活性負(fù)調(diào)節(jié)、脂肪酸衍生物代謝過程、上皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控和生物氧化等通路。見表3、圖1。基因本體(Gene Ontology,GO)分析主要生物過程集中紅細(xì)胞吸收氧氣并釋放二氧化碳、角化、核心組織、超分子纖維組織、血壓調(diào)節(jié)和整合素途徑。見圖2。

表3 差異表達(dá)蛋白的通路富集

圖1 差異表達(dá)蛋白通路富集

圖2 GO富集分析主要生物過程

3 討論

CRC是胃腸道中常見的惡性腫瘤，在我國以41～65歲人群發(fā)病率較高。近20年來，尤其在城市中，發(fā)病率明顯上升[4]。CRC的發(fā)病發(fā)展是多步驟、多階段及多基因參與的過程[5]。以往關(guān)于CRC的研究大多是基于其臨床病理數(shù)據(jù)(例如腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、淋巴結(jié)及血管浸潤等)和單分子生物標(biāo)志物[例如癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen，CEA)及糖類抗原199(Carbohydrate Antigen199，CA199)、CA125等]所作的預(yù)測[6-8]。隨著研究的不斷進(jìn)展，研究者認(rèn)為基于蛋白水平的研究相較于RNA水平更有利于在臨床上應(yīng)用[9]。

考慮到影像學(xué)在CRC分期中的影響[10-12]，課題組均以術(shù)后標(biāo)本病理結(jié)果進(jìn)行臨床分期作為納入標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。在通過比較血瘀證腫瘤組織和正常組織的差異表達(dá)蛋白發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白主要集中在紅細(xì)胞吸收氧氣并釋放二氧化碳、超分子纖維組織、表皮細(xì)胞分化、核心組織、NABA核心母體、對無機物的反應(yīng)、Nop56p相關(guān)前rRNA復(fù)合體、中性粒細(xì)胞遷移、DNA結(jié)合的調(diào)控、水解酶活性負(fù)調(diào)節(jié)、脂肪酸衍生物代謝過程、上皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控和生物氧化等過程中。

既往有研究發(fā)現(xiàn)在大腸癌發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，某些病理因素導(dǎo)致機體循環(huán)障礙而發(fā)生組織缺氧，使血管活性因子之間的動態(tài)平衡發(fā)生改變，表現(xiàn)出不同程度的外周微循環(huán)障礙[13]，血瘀證CRC患者的組織存在明顯缺氧癥狀，“血管生成開關(guān)”動態(tài)平衡發(fā)生改變，引發(fā)血管的高阻力狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)生大腸癌血管新生的病理變化，并進(jìn)一步研究證明活血化瘀中藥可能是通過調(diào)節(jié)缺氧微環(huán)境來抑制大腸癌血管新生，也為缺氧致血瘀提供了有力的科學(xué)依據(jù)[14]。這與本研究發(fā)現(xiàn)的血瘀證腫瘤組織和正常組織的差異表達(dá)蛋白集中在紅細(xì)胞吸收氧氣并釋放二氧化碳的生物過程中的結(jié)果有相同之處。

CRC血瘀證腫瘤組織與正常組織的差異表達(dá)蛋白的研究，為研究中醫(yī)證候本質(zhì)提供了一些新的方向，但仍有其技術(shù)的局限性。在中醫(yī)證候本質(zhì)的研究中，除蛋白組學(xué)外，研究者還嘗試應(yīng)用多數(shù)據(jù)庫分析[15-16]、代謝組學(xué)[17-19]、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)[20]、系統(tǒng)生物學(xué)[21-22]、表觀遺傳學(xué)[23-24]以及基因多態(tài)性[25]等方法來嘗試相關(guān)研究，為該領(lǐng)域研究方法的探討提供了更多的研究方案和思考。