真菌毒素適配體篩選技術研究進展

鄭夢瑤，葉 金, 劉洪美, 謝巖黎, 王松雪

(河南工業(yè)大學糧油食品學院1，鄭州 450001) (國家糧食和物資儲備局科學研究院糧油質量安全研究所2，北京 102600)

真菌毒素是真菌在生長過程中所產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，目前已被鑒定出300～400種，其中對人和動物的健康構成嚴重威脅的主要為黃曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、伏馬毒素(FB)和T-2毒素等[1, 2]，廣泛存在于大麥、小麥、玉米、燕麥、花生等及其制品中，普遍具有致癌、致畸、免疫毒性、遺傳毒性和神經(jīng)毒性等危害，表1具體展示了不同毒素的毒性、污染分布及其限量值。據(jù)報道，目前真菌毒素的污染問題仍遍布全球，發(fā)生率可達60%～80%[3]，遠超過糧農(nóng)組織(FAO)對全世界糧食真菌毒素污染率25%的估計[4]，每年約造成一萬億千克的糧食損失[5]。除此之外，受真菌毒素污染的飼料也會導致動物中毒甚至死亡，并可能在動物體內蓄積，最終進入食物鏈[2]，對人類健康構成威脅。面對這些真菌毒素污染問題，迫切需要快速便攜、高效靈敏的檢測技術。目前，該類產(chǎn)品的研發(fā)主要依托的特異性識別元件是具有高親和力、高特異性、高均一性等特點的抗體[6]。我國90%以上的抗體依靠進口，抗體由于價格昂貴、批次間差異性大、熱穩(wěn)定性差、運輸保存困難等缺點阻礙了我國免疫分析技術的開發(fā)和應用。

表1 主要真菌毒素基本概況

適配體(Apt)，是一種能與多種靶標分子如毒素[7]、抗生素、分子標記物、重金屬、蛋白質和細胞[8]等進行高親和力和特異性結合的寡核苷酸分子，主要為RNA、ssDNA 2種形式。Ellington等[9]借助隨機RNA文庫在體外篩選得到能與有機染料結合，并具有特定結合位點的RNA分子-適配體。這種經(jīng)過多輪體外指數(shù)富集篩選(SELEX)得到的靶標分子-適配體具有合成簡單、化學修飾方便、熱穩(wěn)定性強、免疫原性小、幾乎無批次間差異、易于保存運輸?shù)忍攸c，有望取代抗體[10, 11]，適配體與抗體的特性對比見表2。盡管如此，但目前有關適配體商業(yè)化的應用仍舊很少[12, 13]，遠不能滿足實際所需[14]。

表2 適配體與抗體對比[10，31-37]

首先對現(xiàn)有真菌毒素適配體篩選方法進行了概述，并分析總結了其篩選的基本框架和各種篩選技術所篩適配體的情況以及適配體商業(yè)化應用仍舊很少的原因。在此基礎上，又分析了各種篩選技術所面臨的問題和挑戰(zhàn)，以期為獲得更多性能極佳的真菌毒素適配體提供參考，促進真菌毒素污染問題的解決。

1 真菌毒素適配體篩選方法概況

1.1 體外指數(shù)富集篩選(SELEX)技術

SELEX技術是適配體體外篩選的一個開端，也是各種新型篩選技術開發(fā)的切入點和參照對象。目前用于真菌毒素的SELEX技術根據(jù)其分離原理可以分為靶標固定型篩選技術，如親和柱-SELEX、磁珠-SELEX；文庫固定型篩選技術，如捕獲-SELEX；和非固定型篩選技術，如氧化石墨烯-SELEX。

1.1.1 靶標固定型篩選技術

靶標固定型篩選技術是指通過一定的技術手段將靶標分子固定于諸如瓊脂糖微球、磁珠、凝膠-溶膠顆粒等載體上，再結合SELEX技術獲取適配體的一種改良型篩選技術。

1.1.1.1 親和柱-SELEX

Cruz-Aguado等[32]借助親和柱-SELEX，得到了OTA的適配體1.12.2，并設計了適配體親和柱用于小麥粉樣品OTA的檢測，這是適配體在真菌毒素分析中的首次應用。同年，Gruz-Aguado等[33]又證明了熒光偏振(FP)可以檢測熒光標記的寡核苷酸分子-靶標分子的位移，基于此開發(fā)了以適配體為識別元件的FP檢測方法。在真菌毒素檢測領域，盡管已有適配體相關檢測方法的研究，但是適配體親和力很低，只有μmol/L級別，如OTA適配體1.12.2 的Kd值為0.2 μmol/L。 Setlem等[34]引入3輪反篩得到了nmol/L級別的AFB1適配體AFLA5，AFLA53和AFLA71，其原理如圖1a，大大提高了適配體的親和力。秦鳴蔚[35]利用Sepharose 6 B免疫親和材料作為介質，得到了DON適配體DON-A15和DON-A16。親和柱-SELEX技術打開了真菌毒素適配體篩選的新途徑，具有極高的分離效率，但其非特異性結合較高，且與靶標結合較強的序列很難洗脫，因此周期性也較長。

1.1.1.2 磁珠-SELEX(Mag-SELEX)

Stoltenburg等[36]在經(jīng)典-SELEX法篩選的基礎之上，創(chuàng)建了熒光標記磁珠-SELEX(FluMag-SELEX)，其原理如圖1b。McKeague等[4]借助磁珠-SELEX，獲得了FB1適配體FB139。Barthelmebs等[37]經(jīng)過14輪的篩選獲得了OTA適配體H12。Chen等[38]同樣經(jīng)過14輪篩選獲得ZEN適配體8Z31。Mckeague等[39]經(jīng)過15輪的篩選，獲得了OTA適配體A08。Ma等[40]經(jīng)過10輪的篩選，獲得了AFB2適配體17。Mag-SELEX技術是目前為止真菌毒素適配體篩選中應用最多的技術，其操作簡單，分離效率較高，靶標分子范圍廣，但其篩選周期較長，通常需要5～14輪，樣品消耗量大，靶標的固定常需要對目標分子進行共價修飾，且靶標固定后會產(chǎn)生空間位阻，影響ssDNA與靶標的結合，進而影響篩選適配體的親和力和特異性。

1.1.2 文庫固定型篩選技術

文庫固定型篩選技術是將文庫固定在磁珠、瓊脂糖顆粒等基質上，而使待篩靶標以游離的方式與文庫進行孵育結合，此時與靶標分子結合的序列會因構象變化而從基質上解離進入溶液中，借助外加磁場，離心等方式即可獲得與靶標結合的ssDNA上清液。常見的文庫固定型篩選技術為捕獲-SELEX(Capture-SELEX)。Zhang等[41]經(jīng)過8輪的篩選獲得Kd值為(15.2±3.4)nmol/L的ZEN適配體Z100，其原理如圖1c。Capture-SELEX技術因無需固定靶標，從而消除了空間位阻的影響，使靶標的結合位點得以充分的暴露，保證了篩選適配體的親和性，但文庫固定一方面可能降低文庫的豐度和序列的多樣性，導致起始固定文庫中高親和力、高特異性核酸適配體的缺失；另一方面通過堿基互補配對方式固定的文庫存在動態(tài)解離平衡過程，增加了篩選難度[42]。這些問題使得Capture-SELEX在真菌毒素適配體篩選中的應用相對較少。

1.1.3 非固定型篩選技術

目前小分子靶標篩選領域較為常見的非固定型篩選技術當屬氧化石墨烯-SELEX(GO-SELEX)。

GO-SELEX具有操作簡單，無需固定靶標和文庫的特點。氧化石墨烯(GO)由石墨烯氧化而來，氧化后含氧官能團增多，因而可通過π-π堆積作用吸附ssDNA的堿基，而ssDNA-靶標復合物的堿基被包裹在雙螺旋結構內，因此不會被吸附，進而可通過離心沉淀實現(xiàn)ssDNA-靶標復合物和ssDNA的分離[10]。WOOKIM等[43]首次借助GO可在非均相溶液中分離ssDNA的能力建立了非固定化GO-SELEX篩選方法，篩選了Nampt蛋白適配體。Chen等[44]借助GO-SELEX得到T-2毒素適配體Seq.16，其原理如圖1d，表明了該技術可以用于真菌毒素適配體篩選。李敏[45]獲得了OTA適配體Seq.14。張敏[46]獲得了AFB1適配體AFB-8，并以此適配體為特異性識別探針，納米金作為指示劑，建立了一種AFB1比色檢測方法。GO-SELEX技術相較于固定篩選的方法操作更加簡單，消除了靶標固定的繁瑣步驟以及文庫固定所帶來的高親和力和特異性適配體缺失的風險，但如果靶標會被GO吸附，則無法進行GO-SELEX篩選[10]。此外，ssDNA從GO表面自解吸附，會降低篩選的效率。

圖1 技術基本原理

1.2 真菌毒素適配體篩選技術流程

圖2 SELEX篩選技術基本原理[12]

隨著科學技術的進步，適配體篩選技術也在不斷地完善，逐步趨向于更加高效、便捷、經(jīng)濟等。無論是經(jīng)典-SELEX還是“改良型”-SELEX，其篩選流程大致相同，如圖2，可劃分為[10, 42]：隨機寡核苷酸文庫的準備：文庫由隨機序列區(qū)和引物結合區(qū)組成，可以是ssDNA文庫或RNA文庫，其序列種類約為1015～1018種。孵育結合和分離洗脫：在特定條件下，將靶標與文庫共同孵育，使之形成靶標-ssDNA復合物，借助特定的分離方法分離出靶標-ssDNA復合物，如圖3、圖4所示。負篩和反篩：負篩去除與磁珠等載體和離心管作用的非特異序列，反篩去除與靶分子結構類似物或環(huán)境共生真菌毒素結合的非特異序列，此外，增加洗滌次數(shù)還可除去與靶標分子結合弱的序列。PCR擴增及單鏈制備：對具有親和力的序列進行PCR指數(shù)擴增富集，并借助熱變性、親和柱分離、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等分離手段，制備單鏈寡核苷酸，形成次級文庫。重復循環(huán)：使用次級文庫再次進行篩選，并重復循環(huán)若干輪，使親和力和特異性弱的序列被逐步淘汰。測序分析：對最后一輪篩選獲得的ssDNA或RNA進行克隆測序，并借助DNAMAN、RNA Structure等軟件進行序列結構分析，選出適配體候選序列。親和力和特異性分析：可借助微量熱泳動技術、熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、表面等離子共振法、等溫滴定量熱法等方法進行親和力特異性分析。

圖3 固定篩選技術原理[34, 47]

圖4 非固定篩選技術原理[48]

表3 已報道的真菌毒素適配體序列

1.3 所篩真菌毒素適配體情況及商業(yè)化應用實際情況

經(jīng)過SELEX獲得的適配體，具有化學修飾方便、熱穩(wěn)定性強、免疫原性小、幾乎無批次間差異等特點，有望成為協(xié)助農(nóng)作物生產(chǎn)加工過程中真菌毒素實時檢測和監(jiān)控技術開發(fā)、靶向降解等的工具[49-52]。目前已報道出多種適配體見表3，但有關適配體商業(yè)化應用仍舊很少[12, 13]，遠不能滿足實際所需[14]。究其原因主要有：適配體本身異質性太大，其構象易受環(huán)境如溫度、pH值的影響，表面固載模式下適配體易酶解導致穩(wěn)定性差、壽命短等問題，并且缺乏統(tǒng)一標準的適配體評價方法，主要表現(xiàn)為：同一靶標可存在多種適配體，且適配體長度不一；不同長度序列的適配體其構象性質不同；同一適配體在不同的應用環(huán)境中所表現(xiàn)出的性能也各不相同等。真菌毒素適配體“黑匣子”式的篩選方法存在篩選過程耗時，勞動強度大，經(jīng)費耗損嚴重，效率低，重復性差，且所篩適配體性能無法保證等問題。與大分子靶標篩選相比，小分子靶標特異性結合位點少[53]，與適配體結合前后分子量變化小，因而固定、分離困難，且更易受環(huán)境基質影響，導致所篩適配體與靶標沒有親和活性，增大了篩選的難度。

2 真菌毒素適配體篩選技術所面臨的問題和挑戰(zhàn)

全方位了解現(xiàn)行真菌毒素適配體篩選技術所面臨的問題和挑戰(zhàn)有助于推動小分子靶標適配體篩選進程，進而促進更多高親和力、高特異性適配體的產(chǎn)生，為適配體相關應用奠定夯實的基礎。如表4所示，各種適配體篩選技術都存在一定的局限性。

2.1 靶標固定型篩選技術

靶標固定型篩選技術在小分子靶標適配體篩選中，常常會因為小分子物質結合位點少、難以固定等導致篩選困難、周期性較長、且價格較為昂貴等問題。其固定一般會采取一定的手段進行修飾或轉化靶標分子，如王文鳳[60]借助甾族化合物羧基化反應，將羧基修飾在AFB1和AFB2上，使其能夠通過酰胺反應固定在氨基化磁珠上。同樣Chen等[38]為將ZEN固定在氨基化磁珠上先將其改造為玉米赤霉烯酮-肟(ZENO)，使其分子結構中帶有一個羧基，再通過酰胺反應固定在氨基化磁珠上。在修飾或轉化的過程中，不免會存在靶標分子修飾過度、活性位點轉變或丟失等問題[47]，且靶標固定后會產(chǎn)生空間位阻，進而影響ssDNA與靶標的結合，因此需要一系列表征，這無疑會增大勞動強度和科研經(jīng)費的使用。此外，固定基質的引入，也會造成非特異性結合，進而加大了篩選難度。

2.2 文庫固定型篩選技術

文庫固定型篩選技術雖不需要固定靶標，避免了靶標過度修飾、活性位點轉變或丟失、非特異性結合等問題，但文庫的固定限制了ssDNA的多樣性，以及文庫的豐度，有可能造成原始文庫中優(yōu)良適配體的缺失。另外，當文庫與靶標孵育結合時，若目標序列不能產(chǎn)生構象變化或產(chǎn)生很弱的構象變化，則很難與基質分離，導致篩選失敗。通過堿基互補配對方式固定的文庫存在動態(tài)解離平衡，使得不與靶標結合的序列也從文庫固定基質上解離落入溶液中，造成部分假陽性，降低篩選效率，增大篩選難度。

表4 主要真菌毒素適配體篩選方法所面臨的問題和挑戰(zhàn)

2.3 非固定型篩選技術

非固定型篩選技術相較于固定篩選操作更加簡單，消除了因固定所帶來的一系列問題，在小分子靶標篩選領域最常見的非固定型篩選技術為GO-SELEX，GO對ssDNA獨特的吸附作用使得靶標-ssDNA與ssDNA分離，若靶標會被GO吸附，則無法使用GO-SELEX進行篩選，因此靶標范圍較窄。此外，非特異性序列從GO表面自解吸附，會降低篩選的效率，增加篩選難度。Kou等[61]表示GO表面的吸附能力與核酸序列的長度有關，對短鏈吸附能力較長鏈弱，可以推斷：GO對短鏈吸附弱，自解性強，易導致部分假陽性；而對較長鏈吸附較強，難以從GO上脫落，導致分離困難，降低篩選效率。由此可知，GO-SELEX文庫中核酸序列長度的選擇對適配體篩選是否成功起著至關重要的作用。

3 總結和展望

目前用于真菌毒素適配體篩選的技術主要有親和柱-SELEX、Mag-SELEX、Capture-SELEX、和GO-SELEX，其各自均存在著一定的缺陷，諸如篩選周期長、靶標固定步驟繁瑣且困難、非特異性結合、寡核苷酸文庫豐度和多樣性較低、且固定方式對篩選的難易程度影響較大、靶標范圍小、效率較低等。除此之外，“黑匣子”式的篩選方法還存在經(jīng)費耗損嚴重，重現(xiàn)性差，且所篩適配體性能無法保證等問題。而適配體本身異質性又大，其構象易受環(huán)境如溫度、pH值的影響，表面固載模式下適配體易酶解導致穩(wěn)定性差、壽命短等，這都限制了適配體的商業(yè)化應用。

未來，可針對現(xiàn)有真菌毒素適配體篩選技術進行改進優(yōu)化從而促進多樣化篩選技術產(chǎn)生，比如，無需固定且可同時篩選多個靶標適配體的微流控-SELEX技術；可實時測量靶標與適配體親和力的石英晶體微天平-SELEX技術；以及可高效分離，樣品用量少，篩選成本低的毛細管電泳-SELEX等，從而有助于挖掘更多可適用于不同基質的真菌毒素高親和力、高特異性適配體，再借助適配體易于修飾的優(yōu)點，實現(xiàn)真菌毒素適配體在農(nóng)產(chǎn)品、飼料、食品以及中藥材等實際樣品中的商業(yè)化應用。