不同品種大豆多酚含量與其抗氧化性的關(guān)系研究

楊鑫鑫，黃雨洋，衣程遠(yuǎn)，李 穎，郭汝杞，朱秀清

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院；黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150028)

大豆是一種高蛋白、高脂肪的豆類植物，其中還含有維生素、多酚等活性成分，具有獨(dú)特的營養(yǎng)價值，一直是中國人食用蛋白質(zhì)的主要來源。大豆中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高(5%)，且由于多酚對自由基有很強(qiáng)的清除能力，大豆被稱為天然的抗氧化食品[1-3]。

多酚中至少含有一個帶羥基的芳香環(huán)，在植物中最常見分布最廣是人類飲食中最豐富的抗氧化劑[4,5]。多酚在氧化反應(yīng)中起到還原劑的作用，通過氫原子轉(zhuǎn)移或單電子轉(zhuǎn)移機(jī)制而使其具有抗氧化能力[6-8]。Xu等[9]和朱怡霖等[10]研究表明，隨著多酚含量的增加其抗氧化能力也增大，但是目前對多酚含量和測定各種抗氧化能力指標(biāo)之間的相關(guān)性還鮮有研究和報道。

鐵還原力、總氧自由基清除力、總自由基捕獲能力、DPPH、ABTS以及清除活性氧自由基能力等都是評價抗氧化能力的指標(biāo)[11,12]。本研究以20種大豆品種為原料，通過測定總酚含量以及4種抗氧化能力DPPH、ABTS、鐵還原能力和羥自由基清除率，利用主成分分析法篩選抗氧劑能力最強(qiáng)的大豆品種以及確定評價大豆抗氧化能力的主要指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20種大豆品種：黑農(nóng)83、黑農(nóng)61、黑農(nóng)52、黑農(nóng)69、黑農(nóng)64、綏農(nóng)56、黑農(nóng)66、黑農(nóng)87、黑農(nóng)62、黑農(nóng)48、綏農(nóng)50、黑河43、金源55、綏農(nóng)43、東農(nóng)252、東富3號、合豐55、黑河53、東農(nóng)小粒豆1、佳密豆6號。

Folin-Ciocalteu試劑、DPPH試劑、ABTS試劑、水楊酸、鐵氰化鉀、石油醚、甲醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha-1506型紫外-可見分光光度計，SB-5200DTD型超聲波清洗機(jī)，F(xiàn)A224型分析天平，TDL-5-A型臺式離心機(jī)，R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

取各參試大豆粉碎過篩，準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品，加入50 mL石油醚震蕩脫脂24 h，在40 ℃下用100 mL 80%的甲醇溶液超聲提取2次，每次30 min，然后4 000 r/min離心15 min，收集上清液，殘?jiān)酝瑯拥姆椒ㄖ貜?fù)提取2次，合并3次提取液，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用甲醇定容至50 mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹13，14]。

1.3.2 多酚含量測定

參考張清安等[15]的方法，采用Folin-Ciocalteau法測定多酚含量。準(zhǔn)確移取1.3.1中的提取液1.0 mL，分別加入10 mL蒸餾水和1.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，搖晃30 s至均勻，靜置5 min后加入10% Na2CO36.0 mL，加水定容至25.0 mL，置于30 ℃水浴避光反應(yīng)2 h，用1 mL 80%甲醇代替樣品做空白，在765 nm波長處測定吸光度A。以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)品代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=5.253 5+0.035 2x，R2=0.990 7。樣品中的總酚以沒食子酸的含量表示，單位為 mg/g。根據(jù)式(1)計算多酚含量。

X=(C×50×A)/m

式中：X為試樣中的多酚含量/mg/g；C為試樣測定液中沒食子酸的濃度/mg/mL；A為樣品稀釋倍數(shù)；50為試樣測定液定容體積；m為試樣的質(zhì)量/g。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測定

選取黑農(nóng)83為試樣，將其配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50% 5個梯度，按以下方法測得各濃度樣液對DPPH的清除率，由此計算該樣液的IC50值，IC50=0.159 4 mg/g。其余樣品的提取液按黑農(nóng)83樣液的IC50進(jìn)行稀釋其稀釋倍數(shù)為13%。

參照文獻(xiàn)[16]的方法測定DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由清除率：準(zhǔn)確移取1.3.1提取液2.0 mL，加入1，1-二苯基-2-三硝基苯肼溶液(2.0 mL)，避光反應(yīng)20 min后測定其吸光值A(chǔ)1(517 nm)；在相同條件下對照組測得的吸光值為A2(無水乙醇代替DPPH)，空白組測得吸光值為A0(無水乙醇代替樣液)。按照式(2)計算樣品對DPPH自由基的清除率。

DPPH.清除率=[1-(A1-A2)/A0)]×100%

(2)

式中：A0為空白組的吸光值；A1為樣品的吸光值；A2為對照組的吸光值。

1.3.4 ABTS自由基清除能力測定

IC50測定：選取黑農(nóng)48為試樣，將其配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、70%、80% 5個梯度，按下面的方法測得各濃度樣液對ABTS的清除率，由此計算該樣液的IC50值，IC50=0.278 7 mg/g。其余樣品的提取液按黑農(nóng)48樣液的IC50進(jìn)行稀釋其稀釋倍數(shù)為24%。

參照CENGIZ S的方法測定ABTS自由基清除率[17]：準(zhǔn)確移取1.3.1提取液0.1 mL加入3.9 mL 2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽溶液，避光反應(yīng)20 min后測定其吸光值A(chǔ)1(734 nm)；在相同條件下對照組測得的吸光值為A2(無水乙醇代替ABTS)，空白組測得的吸光值為A0(無水乙醇代替樣液)，按照式(3)計算樣品對ABTS自由基的清除能力。

ABTS自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0)]×100%

(3)

式中：A0為空白組的吸光值；A1為樣品的吸光值；A2為對照組的吸光值。

1.3.5 羥自由基清除能力測定

采用水楊酸法測定羥自由基清除能力[18]：準(zhǔn)確移取1.3.1提取液0.5 mL加入H2O2(5 mL)搖勻后測定其吸光值A(chǔ)1(510 nm)；在相對條件下，對照組測得的吸光度為A2(用蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液)，空白組測得的吸光度為A0(用蒸餾水代替樣品溶液)，按照式(4)計算樣品對羥自由基清除能力。

羥自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0)]×100%

(4)

式中：A0為空白組的吸光值；A1為樣品的吸光值；A2為對照組的吸光值。

1.3.6 鐵還原力測定

參照文獻(xiàn)[19]等的方法采用鐵氰化鉀法測定鐵還原力：鐵還原力大小用鐵氰化鉀法測定的吸光值大小來表征。

1.4 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均平均測定3次，取其平均值，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行主成分分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆品種的多酚含量及抗氧化能力相關(guān)性分析

如圖1所示，隨著20種大豆品種的不同，其多酚含量、DPPH/ABTS自由基清除能力、鐵還原能力和羥自由基清除率也不同。不同大豆品種的抗氧化能力不同可能是由于多酚含量不同造成的，因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)含有的芳香族特征的結(jié)構(gòu)和多羥基高度共軛體系，它們具有優(yōu)異的還原性能，可以中和其他活性氧，有效清除自由基，能夠作為抗氧化劑，因此多酚含量的不同會直接影響大豆的抗氧化能力[7,20]，這與Xu等[9]和朱怡霖等[10]的研究結(jié)果一致。

評價物質(zhì)抗氧化性能力的方法有許多種，每種方法都有其特定的目標(biāo)對象以及反應(yīng)機(jī)理。本研究測定大豆抗氧化能力的4種方法中鐵還原力測定的是體外總抗氧化能力、DPPH和ABTS自由基清除能力測定的是清除自由基能力、羥自由基清除率測定的是清除活性氧自由基能力[12]。因此這3類方法可以從不同機(jī)制評價不同大豆品種的抗氧化能力。

圖1 不同品種大豆的總酚含量、自由基清除能力、鐵還原能力的變化

大豆抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)之一是酚類化合物的含量，總酚含量與大豆抗氧化能力評價指標(biāo)(DPPH/AABTS自由基清除能力、鐵還原能力和羥自由基清除率)的相關(guān)系數(shù)如表1所示。在本研究中，多酚含量與鐵還原能力和羥自由基自由基清除率呈極顯著相關(guān)性(P<0.01)，與ABTS自由基清除率顯著相關(guān)(P<0.05)，與DPPH自由基清除率無顯著相關(guān)性，這可能是因?yàn)?，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)與多酚類物質(zhì)的反應(yīng)不成相關(guān)性。

表1 大豆的抗氧化能力和總酚含量的相關(guān)系數(shù)

因此，大豆多酚含量和3種類型的抗氧化能力之間有著直接的相關(guān)性，證明它們之間存在著信息的重疊，其中大部分相關(guān)系數(shù)都大于0.3，因此這5個指標(biāo)適合在主成分分析中做因子[21]。通過比較5個單一指標(biāo)，每個品種都存在優(yōu)劣，很難對大豆抗氧化能力進(jìn)行綜合評價，因此需要通過主成分分析建立一套評價大豆抗氧化能力的體系。

2.2 基于主成分分析篩選評價抗氧化能力的指標(biāo)

本研究的主成分分析是利用降維思想，在保證5個指標(biāo)的信息最大程度被保留的前提下把5個指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個綜合指標(biāo)的多元統(tǒng)計方法，其中每個綜合指標(biāo)(主成分)都是原始變量的線性組合，且互不相關(guān)，這就使得主成分比原始的5個指標(biāo)更能評價大豆的抗氧化性[22]。

2.2.1 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理

表2 不同品種大豆多酚含量及抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果

2.2.2 主成分提取和貢獻(xiàn)率

本研究利用SPSS 26.0 對20種大豆品種的總酚含量及抗氧化能力(DPPH/AABTS自由基清除能力、鐵還原能力和羥自由基清除率)共5 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了主成分分析，結(jié)果見表3。

由表3可知成分1和成分2的特征值均大于1，因此提取這2個因子作為主成分，解釋了原有變量總方差的78.09%，可代表原品質(zhì)性狀的絕大部分信息，根據(jù)綜合評價的需要，采用這2個主成分來代替原來的5個指標(biāo)變量[23]。結(jié)合表4不同品種大豆抗氧化能力的荷載值，可知第一主成分的特征值為2.73，貢獻(xiàn)率為54.54%，代表了20種大豆品種抗氧化能力測定結(jié)果54.54%的信息。第一主成分主要要以多酚含量和鐵還原力影響為主，羥自由基清除率為輔，這說明評價大豆抗氧化能力的主要指標(biāo)是多酚含量和鐵還原力。第二主成分的特征值為1.18，貢獻(xiàn)率為23.55%，代表了20種大豆品種抗氧化能力測定結(jié)果23.55%的信息，第二主成分主要以DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率影響為主。

表3 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率

2.2.3 特征向量計算

表4為不同品種大豆抗氧化能力的載荷矩陣，可以代表各變量對主成分的影響程度，其絕對值越大表示對主成分的影響越大。由表4可知多酚含量和鐵還原力是影響主成分1的主要因素，羥自由基清除率是次要因素；ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率是影響主成分2的主要因素。這說明當(dāng)多酚含量和鐵還原力高時，第1主成分較大，DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率高時，第2主成分較大。

表4 不同品種大豆抗氧化能力載荷矩陣

表5 各指標(biāo)的成分系數(shù)得分矩陣

根據(jù)表3中的特征值和表4中各主成分載荷系數(shù)除以主成分相對應(yīng)的特征值開平方根，可以得到表5中各性狀指標(biāo)的成分系數(shù)得分矩陣，通過表5可以分別得到2個主成分的函數(shù)表達(dá)式F1、F2：

F1=0.57X1+0.30X2+0.33X3+0.42X4+0.55X5

Vasu 1897: ?rī?a Chandra Vasu, The Aādhyāyi of Pāini, Benares: Sindhu Charan Bose at the Panini office.

F2=-0.12X1+0.58X2+0.52X3-0.61X4-0.03X5

F=0.545F1+0.235F2

最終得到方程F=0.282 5X1+0.299 8X2+0.302X3+0.086X4+0.292 7X5

式中:X1為多酚含量；X2為DPPH自由基清除率；X3為ABTS自由基清除率；X4為羥自由基自由基清除率；X5為鐵還原能力。

將2個主成分以及各主成分對應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，得到綜合評價函數(shù)：

F=0.545F1+0.235F2，結(jié)果見表6。

2.2.4 大豆抗氧化活性綜合評價

把方程代入數(shù)據(jù)可得最終的排序，見表6。

表6 20種大豆品種的主成分分析綜合得分與排名

表6為20種大豆品種的主成分分析綜合得分與排名，分?jǐn)?shù)越高代表大豆品種的抗氧化能力越強(qiáng)，其中F1和F2的得分表示2個主成分的得分，結(jié)合表3和表4可知第一主成分中以多酚含量和鐵還原力的影響最為顯著，且第一主成分可以代表大豆抗氧化能力測定結(jié)果54.54%的信息。綏農(nóng)56的綜合主成分值為1.28分，是20種大豆品種中綜合主成分的最高值，這說明在這20中大豆品種當(dāng)中，綏農(nóng)56的抗氧化能力最強(qiáng)，它的第一主成分綜合值F1也最高，達(dá)到了2.17分，在20種大豆品種中綏農(nóng)56的多酚含量和鐵還原力分別排第三和第四，這說明用綜合主成分值能較客觀地反映各品種間的品質(zhì)比較。黑農(nóng)48、黑農(nóng)61、黑河53、黑農(nóng)64的綜合分值為1.1、1.0、0.9、0.69，均在0.5分以上，都是抗氧化能力較強(qiáng)的大豆品種，這些品種的多酚含量和鐵還原都較高。東農(nóng)小粒豆1和合豐55的綜合評分為-1.85和-2.06是得分最低的兩種品種，也是總酚含量和鐵還原能力最低的2種大豆品種。

因此，在評價大豆抗氧化能力時多酚含量和鐵還原力是最重要的兩個指標(biāo)。這說明多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力，含量多少能直接影響大豆的抗氧化性。4種評價大豆抗氧化能力的指標(biāo)中鐵還原力最能反映大豆的抗氧化能力，它測定的是大豆的體外總抗氧化能力。

3 結(jié)論

對20種大豆品種進(jìn)行了總酚含量及其抗氧化能力的測定，相關(guān)性分析表明總酚含量與羥自由基清除率和鐵還原能力極顯著相關(guān)(P<0.01)，與ABTS自由基清除率顯著相關(guān)(P<0.05)，與DPPH自由基清除率無顯著相關(guān)性。對20個大豆品種的5個指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，共提取了2個主成分，第1主成分主要要以多酚含量和鐵還原力影響為主，貢獻(xiàn)率為54.54%，結(jié)合綜合排名分析證實(shí)多酚含量和鐵還原力2個指標(biāo)可以作為評價大豆抗氧化性的主要指標(biāo)。從主成分分析綜合評分得到綏農(nóng)56的種子抗氧化能力最強(qiáng)，其次是黑農(nóng)48、黑農(nóng)61、黑河53、黑農(nóng)64，這些種子的抗氧劑能力較強(qiáng)，東農(nóng)小粒豆1和合豐55的抗氧化能力最弱。