不同淀粉對高水分組織化花生蛋白品質影響

關家樂，張一凡，朱 晶，梁春艷，朱旻鵬，肖志剛

(沈陽師范大學糧食學院，沈陽 110034)

高水分組織化植物蛋白具有與動物肉相似的產品特性和感官[1]，營養特性、質地、味道和外觀與肉類相似[2]，在飲食上以組織化植物蛋白替代動物蛋白可降低人們體重、膽固醇和血壓水平，從而降低患心臟病和癌癥的風險[3]。雖然高水分組織化植物蛋白可以與動物肉的纖維結構相媲美，但要達到與動物肌肉組織對產品整體感官特性的影響效果仍然具有挑戰性[4]。通過顯微鏡觀察，擠壓變性的組織化植物蛋白不具有肌肉纖維或纖維束的三維各向異性結構，肌肉纖維的質地及其固定水分的毛細作用才是肉類最理想的結構屬性[5]。所以為了彌補這些差異，通常在植物替代產品中添加各種增稠劑、水結合劑和質地增強劑等以改善組織化蛋白持水和持油性。淀粉具有獨特的增稠、凝膠、黏結、成膜、潤脹、糊化等特性，可作為增稠劑、增強劑，增強組織化蛋白產品保水性，改善口感和色澤，使擠壓過程以及產品的性質穩定[6]。Bon-Yeob等[7]研究表明添加10%玉米淀粉的組織化大豆蛋白比純組織化大豆蛋白具有更好蛋白質網絡結構。Zhang等[8]研究高水分擠壓花生蛋白時，加入2%小麥淀粉，使擠出物氫鍵的數量顯著增加，疏水作用、氫鍵與二硫鍵的相互作用均顯著增強。Nanta等[9]研究羥丙基淀粉對組織化大豆蛋白產品質構特性的影響，添加羥丙基淀粉的組織化蛋白產品的硬度和膠著性均比對照樣品有所降低。木薯淀粉(CS)分子內和分子間存在大量氫鍵，糊化溫度低，能較早吸水溶脹，可改善肉制品的吸水、吸油性。乙酰化二淀粉磷酸酯(ADSP)具有較好的凝膠性，在肉制品中作為凝膠劑、保水劑、增稠劑和組織賦形劑。羥丙基淀粉(HS)在高溫下黏度高并且穩定，與蛋白的加熱變性同時發生可增加蛋白三維網絡結構的穩定性[10]。這3種淀粉均有改善組織化蛋白品質的潛力，研究高水分擠壓條件下淀粉類添加劑與植物蛋白的相互作用，對改善組織化植物蛋白食品的結構和功能具有重要意義。

本實驗利用雙螺桿擠壓機生產高水分組織化花生蛋白，研究木薯淀粉、乙酰化二淀粉磷酸酯和羥丙基淀粉對組織化花生蛋白品質改良和蛋白結構的影響，為組織化植物蛋白的產業化生產提供參考。

1 材料與方法

1. 1 材料與設備

花生蛋白粉(蛋白質質量分數59.6%，干基)；大豆分離蛋白(蛋白質質量分數87.4%，干基)；木薯淀粉、乙酰化二淀粉磷酸酯、羥丙基淀粉，均為食品級；磷酸鹽緩沖液、尿素(Urea)、十二烷基硫酸鈉(SDS)，均為分析純；2-巰基乙醇(2-ME)為生物級。

DS56-Ⅲ雙螺桿擠壓機；CT3質構儀；CR-400色彩色差計；VETEX80傅里葉紅外光譜儀；S4800掃描電子顯微鏡；Scientz-12冷凍干燥機；DR-3000酶標分析儀。

1. 2 方法

1.2.1 高水分組織化花生蛋白的制備

采用雙螺桿擠壓機擠出、冷卻成型，擠壓機由進料、擠壓和控制系統組成，螺桿直徑36 mm，長徑比為40∶1。花生蛋白粉和大豆分離蛋白按4∶1比例混合，將木薯淀粉、乙酰化二淀粉磷酸酯和羥丙基淀粉分別按0%、3%、6%、9%和12%的比例加入后混合均勻。擠壓參數設置：5段控溫雙螺桿擠壓機各段由進料端至出料端的溫度設置分別為60、80、130、160、160 ℃，螺桿轉速 280 r/min，喂料速度8.5 kg/h，冷卻溫度55 ℃、物料含水量60%。

1.2.2 組織化度測定

樣品裁剪形狀如圖1所示，厚度為10 mm，擠出方向如圖1所示(FV)。采用 NONE 探頭和TA-SBA夾具對樣品進行剪切，剪切程度為樣品厚度的70%，設置測試前速度、測試速度和測試后速度均為1 mm/s，組織化度為橫向剪切力所做的功與縱向剪切力所做的功的比值[11]，每個樣品測量5次，取平均值。

圖1 組織化度測定樣品形狀示意圖

1.2.3 色澤測定

采用色差儀對花生蛋白組織化樣品的5個不同部位測定色澤，取平均值，應用L*、a*、b*表色系。L*為明度指數，值越大表明被測物越白亮。a*為紅色度、b*為黃色度，ΔE表示產品與白色板的色差。

(1)

1.2.4 質構測定

選取硬度、內聚性、彈性、咀嚼性和膠著性5個指標反映擠出物的質構特性。測定樣品邊長為25 mm的正方形。質構儀的操作參數為：TPA 模式，探頭 TA7，測試前、后速度均為1.0 mm/s，下壓程度10%。每個樣品測量5次，取平均值。

1.2.5 吸水、吸油能力

吸水能力(WAC)和吸油能力(OAC)的測定采用Sosulski等[12]方法，并略有修改。WAC測定：2 g凍干研磨樣品與30 mL蒸餾水充分混合1 min，3 000 r/min離心30 min，離心后丟棄上清液，稱樣品的離心管質量，WAC表示為每克樣品吸收水量。OAC測定：將1 g凍干研磨樣品與10 mL玉米油于預稱重的離心管中混合，攪拌2 min，使樣品完全分散在油中，28 ℃靜置30 min，3 000 r/min離心30 min，丟棄上清液倒置10 min，瀝干油后稱重，OAC表示為每克樣品吸油量。所有樣品均重復測定3次取平均值。

(2)

(3)

式中：m0、O0為干燥樣品質量/g；m1、O1為離心管與樣品總質量/g；m2、O2為離心管與沉淀物總質量/g。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析(FT-IR)

根據Wang等[13]方法，準確稱量2 mg樣品及198 mg KBr ，使用液壓機將其制成1～2 mm厚薄片。共進行了64次掃描，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為400～4 000 cm-1。溴化鉀粉末作為空白，通過peakfit軟件進行紅外光譜擬合處理求蛋白質二級結構含量。

1.2.7 蛋白質溶解度測定

根據張金闖[14]的方法配制浸提溶劑：①0.04 mol/L pH 7.6，磷酸鹽緩沖液(P)；②pH 7.6，P+8 mol/L Urea溶解液；③pH 7.6，P+0.1 mol/L 2-ME溶解液；④pH 7.6，P+1.5%SDS溶解液；⑤ pH 7.6，P+8 mol/L Urea+0.1 mol/L 2-ME溶解液；⑥ pH 7.6，P+8 mol/L Urea+1.5%SDS溶解液；⑦pH 7.6，P+1.5%SDS+0.1 mol/L 2-ME溶解液；⑧pH 7.6，P+8 mol/L Urea+1.5%SDS+0.1 mol/L 2-ME溶解液。

樣品浸提與稀釋：不同擠壓區段樣品經過冷凍干燥后，粉碎，過80目篩網。取粉狀樣品0.25 g于25 mL燒杯中，分別加入10 mL8種溶劑，常溫下攪拌浸提1 h后，放入冰箱4 ℃保存，離心(12 000 g，10 ℃，15 min)，取上清液。沉淀中再分別加入10 mL 8種浸提溶劑，重復浸提2次，離心。取0.05 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.95 mL去離子水，將上清液稀釋20倍，用搖床混勻(160 r/min，1 h)。加20 μL上清液到 96 孔酶標板中，采用 Lowery法測得(測定波長650 nm)上清液中可溶性蛋白含量，原料和擠出樣品中總的蛋白質含量采用凱氏定氮法測定。

蛋白質白質溶解度=

(4)

總蛋白質量濃度=

(5)

根據 Chen等[15]的方法，對蛋白質不同結合狀態化學交聯鍵分析：(1)天然狀態蛋白，①；(2)氫鍵，②-①；(3)二硫鍵，③-①；(4)疏水相互作用，④-①；(5)氫鍵和二硫鍵交互作用，⑤+①-②-③；(6)氫鍵和疏水相互作用交互作用，⑥+①-②-④；(7)疏水相互作用和二硫鍵交互作用，⑦+①-③-④；(8)氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵交互作用，⑧+②+③+④-①-⑤-⑥-⑦。

1.2.8 掃描電子顯微鏡(SEM)

將擠壓樣品沿縱向切割，樣品冷凍干燥48 h，并使用場發射掃描電子顯微鏡在5 kV電子束操作下分析擠壓樣品切面微觀結構，放大倍數500倍。

1.3 數據處理與分析

運用SPSS軟件進行統計分析，每組實驗做3次平行，采用Duncan對數據進行顯著性分析(P<0.05)，利用Origin 2017軟件對數據進行繪圖處理，結果的表達采用平均值±標準偏差的方式。

2 結果與討論

2.1 淀粉對花生蛋白產品組織化度的影響

由圖2可知，隨著ADSP和HS含量的增加，產品組織化度先增加后降低，添加3%的ADSP和6%的HS可提高產品組織化度，而添加CS對產品組織化度沒有顯著改善。添加少量淀粉可提高產品組織化度，改善組織結構，產品纖維狀結構比較細，排列緊密。這說明添加淀粉有利于沿擠壓方向形成纖維結構，使組織化蛋白產品結構緊密。分散在蛋白質分子之間的淀粉可以改善蛋白的流動性和柔韌性，進一步促進各向異性纖維結構的形成。添加12%CS、12%ADSP和12%HS組織化度下降，纖維狀結構比較粗，結構松軟。添加大量淀粉形成的淀粉-蛋白質復合物會阻礙蛋白質的結合和聚合，此外，淀粉和蛋白之間的作用力可能導致產品更高的表面張力，從而阻止纖維結構的形成[16]。淀粉含量越高，淀粉本身的膨化作用增大了組織化蛋白產品組織結構間的縫隙，不利于產品成型。

圖2 淀粉對組織化蛋白產品組織化度的影響

2.2 淀粉對組織化花生蛋白產品色澤的影響

由表1可知，隨著淀粉含量的增加組織化蛋白產品L*值逐漸升高，a*、b*和ΔE降低，產品色澤越來越明亮。常曉明等[17]研究表明淀粉的添加顯著地影響了大豆組織化蛋白的顏色，并且添加量越高產品顏色越淺。添加ADSP組織化蛋白產品L*值顯著高于另外2種淀粉，且產品a*、b*和ΔE顯著低于其他淀粉，這可能由于ADSP糊化后比其他2種淀粉具有更高的透明度。添加CS組織化蛋白產品L*值較低，可能由于CS中含有較多的支鏈淀粉，支鏈淀粉能促進蛋白質分子間的相互作用，導致游離氨基的丟失[18]，有利于發生美拉德反應導致產品顏色加深。Hellemans等[19]研究表明支鏈淀粉對分子降解更為敏感，會轉化為短鏈糊精和低聚糖，它們可能通過美拉德反應與蛋白質的氨基相互作用。

2.3 淀粉對組織化花生蛋白產品質構特性的影響

如表2所示，隨著CS和ADSP添加量的增加，產品硬度、膠著性和咀嚼性降低，這與Phawinee等[9]研究結果一致。蛋白與淀粉混合物在加熱過程中表現出互相獨立的熱特性，淀粉的存在會與蛋白競爭水分，添加大量淀粉不利于形成蛋白質多孔網絡結構，導致組織化蛋白產品質地松軟。但CS添加后對產品內聚性和彈性影響不顯著，ADSP可增加產品彈性。隨著HS添加量的增加，產品內聚性升高，彈性和咀嚼性降低，HS的添加雖使產品硬度與膠著性降低，但在6%添加量時，產品的硬度、咀嚼性和膠著性仍較大。表明添加6%HS可增強蛋白三維網絡結構的穩定性，有利于擠壓組織化蛋白產品高纖維狀結構的形成。羥丙基淀粉因氫鍵作用較弱，二硫鍵作用加強，蛋白三維網絡結構得到穩定。

表1 淀粉對組織化花生蛋白產品色澤的影響

表2 淀粉對組織化花生蛋白產品質構特性的影響

2.4 淀粉對組織化花生蛋白吸水吸油能力的影響

由圖3可知，添加ADSP和HS后組織化蛋白的WAC略有提高，這可能由于ADSP和HS與蛋白以及與水分子之間的相互作用，使組織化蛋白具有更高孔隙率。而CS在添加量為6%、9%的條件下WAC基本不變，3%和12%的條件下WAC略有提高，且與ADSP和HS相同添加量時的WAC相近。由于HS與蛋白的加熱變性同時發生，二硫鍵作用加強，蛋白三維網絡結構比較穩定，吸水能力比較強，HS添加量為12%時組織化蛋白吸水能力最強。在相同條件下，添加CS的樣品吸水性低于添加ADSP和HS的樣品，這可能由于木薯淀粉糊化溫度較低，較早的吸水溶脹，不利于同蛋白質共同形成多孔網絡結構。

由圖4可知，添加3種淀粉均可提高組織化蛋白的OAC，在添加量相同的條件下，HS對OAC的提高最大，ADSP次之，CS最小。CS在添加量為3%時吸油力最高，ADSP添加為12%時吸油力最高，HS在添加量為9%時吸油力最高。原因可能是淀粉的糊化加大了物料的膨化，使得蛋白質凝聚度降低，結構越來越疏松，氣腔增大，持水性、持油性變好，同時淀粉與油脂可以形成淀粉-脂肪復合物，使樣品吸油能力逐漸增加。楊勇等[20]采用高濕擠壓技術制備玉米淀粉-大豆分離蛋白基素肉，玉米淀粉添加量控制在 3%～4%范圍內，持水性和持油性相對較高。

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 淀粉對組織化花生蛋白吸水能力的影響

圖4 淀粉對組織化花生蛋白吸油能力的影響

圖5 添加不同淀粉的組織化蛋白紅外譜圖

圖6 不同淀粉對組織化蛋白樣品比率的影響

表3 淀粉對組織化花生蛋白二級結構的影響

酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)是研究蛋白質二級結構最敏感的光譜區，主要由肽鏈的C—O伸縮振動引起[24]。如圖5所示，1 658 cm-1附近譜帶強度大，表明β-折疊及β-轉角結構為組織化花生蛋白酰胺Ⅰ帶中主要構成。由表3可知，不同淀粉的加入對組織化蛋白二級結構中的α-螺旋及β-轉角結構無顯著影響，隨著CS添加量的增加，β-折疊結構比例先增加后減小，無規則卷曲比例不斷減小，說明部分無規則卷曲結構轉變為β-折疊結構，在CS添加量為9%時，β-折疊比例最高；隨著ADSP添加量增加，β-折疊含量先增加后減少，與之相應，無規則卷曲比例先減小后增加；隨著HS添加量的增加，無規則卷曲含量逐漸降低，β-折疊不斷增加。加入少量淀粉可提高組織化蛋白β-折疊結構含量，但淀粉添加量過多會使β-折疊結構含量降低，進而影響組織化蛋白產品的質構、感官等特性。

2.6 淀粉對組織化花生蛋白化學交聯鍵變化分析

組織化蛋白化學交聯鍵的變化可用蛋白在不同浸提溶液中的溶解度來表示，組織化蛋白樣品在浸提溶液中溶解度的不同表明組織化蛋白產品化學鍵結構的多樣性。蛋白溶解度越高，表明組織化蛋白中化學鍵作用越強。如圖7所示，與原料相比，擠壓組織化蛋白氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用逐漸減弱，化學鍵之間的交互作用逐漸增強，可能是由于擠壓蛋白質變性會導致氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用向更為復雜的綜合作用力轉變，維持其構象的作用力變得更為復雜[25]。隨著淀粉添加量的增加，蛋白質分子間疏水相互作用顯著增強，這可歸因于淀粉本身的吸水作用，由于淀粉競爭水分，蛋白質中的疏水側鏈避開水而聚集到蛋白質內部，而不是被水溶劑化。由圖7可知，疏水相互作用和二硫鍵交互作用是維持組織化蛋白網絡狀纖維結構的主要作用力，二硫鍵和疏水相互作用在蛋白擠壓聚集過程中起關鍵作用，與Li等[26]研究結論一致。淀粉添加量增加，蛋白質分子間疏水相互作用逐漸增強，疏水相互作用是蛋白質折疊的主要驅動力，表明蛋白分子進一步交聯，使維持組織化花生蛋白構象的作用力變得更為復雜，疏水作用增強也表明了蛋白質折疊和螺旋的穩定。需要說明的是計算氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵之間的相互作用時，由于尿素溶液對氫鍵和疏水相互作用均有破壞作用，導致分析氫鍵和疏水相互作用時的重復計算，得出負值。

2.7 淀粉對產品微觀結構的影響

組織化蛋白沿縱向剪切，切面的掃描電鏡圖如圖8所示。無淀粉添加組織化蛋白結構比較緊密，內部存在纖維狀結構，但纖維呈無序狀排列，纖維間存在較大孔洞。添加一定量CS后，組織化蛋白的結構有所改善，內部纖維組織化結構更明顯，質量分數為6%時內部結構更為有序，但仍存在較大孔洞。添加ADSP和HS可明顯改善組織化蛋白的纖維結構，分別在質量分數為3%和6%時，表現出更細的纖維結構和更有序的排列。添加9%淀粉使組織孔洞增大，組織纖維化程度降低，這與組織化度的結果一致。添加少量淀粉穩定了水分，減少了網絡結構中水分通道的出現，從而促進了致密完整蛋白質網絡的形成。但淀粉添加量過多會破壞蛋白質形成的連續網絡，兩個獨立網絡相互交織很難形成剛性結構[27]，所以組織化蛋白結構變松散，纖維結構比較粗，排列變混亂。

圖8 淀粉對組織化花生蛋白微觀結構的影響(×500)

3 結論

以花生蛋白粉為主要原料，研究CS、ADSP和HS對高水分組織化花生蛋白品質改良和蛋白結構的影響，結果表明：添加少量ADSP和HS有助于產品組織化度的提高，3種淀粉都改善了組織化蛋白產品色澤，產品亮度值增加，降低了產品硬度和咀嚼性。添加ADSP和HS提高了組織化蛋白產品的吸水吸油能力，有利于產品在食品工業中的應用。紅外光譜研究表明淀粉增強了美拉德反應，促進蛋白質二級結構由無規則卷曲向β-折疊轉變。化學交聯鍵變化分析表明，淀粉促進了蛋白質之間疏水相互作用，疏水相互作用和二硫鍵交互作用是維持蛋白質網絡狀纖維結構的主要作用力。掃描電鏡結果表明，淀粉添加有助于蛋白質網絡結構的形成，添加3%ADSP組織化蛋白纖維結構明顯，具有較高的組織化度。ADSP和HS對組織化蛋白品質改良具有更好的效果。