社會隔離對C57BL/6小鼠行為表征的影響*

吳 娜 肖福川 張銘昊 陳柏安1,,3 盧 靜1,,3

(1.首都醫科大學實驗動物部，北京 100069)(2.首都醫科大學基礎醫學院實驗動物學學系，北京 100069) (3. 首都醫科大學基礎醫學院神經再生修復研究北京市重點實驗室，北京 100069)

實驗中常用的嚙齒類動物屬于群居動物，它們之間需要正常的社會接觸，長期隔離飼養容易產生異常的行為和生理特征。社會隔離是社會型生物隔離于其他同類或社會群體，無法達成社交需求的情形狀況。有研究表明，社會隔離會導致成年雄性C57BL/6小鼠攻擊性增強[1]，導致昆明小鼠和BALB/c小鼠的認知缺陷和攻擊性增加，與昆明小鼠相比，BALB/c小鼠在相同年齡和隔離時間時表現出較弱的空間/非空間記憶和較低的攻擊性[2]。有研究認為社會隔離會導致小鼠身體活動減少[3]，相反，也有研究認為小鼠社會隔離增加了多動癥和探索行為[4]。隔離飼養的大鼠在新環境中表現出多動癥[5]，攻擊行為增加[6]，也有報道稱，與群居飼養的大鼠相比，隔離飼養的大鼠變得不那么活躍，產生抑郁樣行為[7-8]。綜上所述，嚙齒類動物在成長過程中，如果長期處于被隔離或孤立狀態，就會在認知、情緒、行為等方面的發展上產生明顯的障礙。但由于研究需要，部分實驗需將動物單獨飼養，致使其社會隔離。然而社會隔離實驗結果各異，隔離養育引起的社會認知功能改變是矛盾的。我們認為可能與實驗中使用的實驗動物的品種、品系、性別及隔離時間不同有關。本研究選擇C57BL/6小鼠作為研究對象，因其是實驗中最常用的小鼠品系，并且大多基因編輯小鼠都是C57BL/6基因背景來源。本研究旨在綜合檢測和評價社會隔離對C57BL/6小鼠日常活動執行能力、學習記憶能力、自主運動能力和探究行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物與分組：SPF級2月齡 C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號【SCXK(京) 2019-0008】。實驗期間動物在首都醫科大學實驗動物部屏障環境【SYXK(京) 2015-0012】飼養，經首都醫科大學實驗動物倫理委員會審查，倫理審批號：AEEI-2015-020 。將 60只小鼠隨機分為2組，每組30只，雌雄各半，對照組群居(5只/籠)飼養，隔離組單籠(1只/籠)飼養。

1.1.2試劑與儀器：壓縮紙片規格為 7.5 cm×8 cm，3 g/片，由中生北動(北京)科技發展有限公司定制。Morris水迷宮由正圓柱體水池、可以改變位置調整高度的透明水下隱蔽平臺、具有追蹤軌跡功能的計算機實時監測分析系統labmaze組成，水池參數為：直徑122 cm；高51 cm；平臺直徑5 cm，水池壁顏色為深灰色，圓形隱蔽平臺為透明材料制成。曠場設備由頂部開放的實驗箱和追蹤軌跡功能的計算機實時監測分析系統supermaze組成，實驗箱是灰色有機玻璃制作的 40 cm×40 cm×40 cm的深灰色無蓋箱體，底面9等分，在其正上方1.5 m處安放燈泡照明，使觀察箱中心光照強度為400 lx。

1.2 方法

1.2.1筑巢實驗：隔離組小鼠單籠飼養8周后，每個籠子里放一個3 g 的方形壓縮棉片；對照組同齡群居小鼠暫時分開，單籠飼養，每個籠子里也放一個3 g 的方形壓縮棉片。48 h后，稱量所有未使用的壓縮棉片質量，精確到 0.1 g，對照組小鼠恢復群居飼養。用筑巢五分評級量表評估筑巢情況，筑巢實驗可用來評估實驗動物的日常活動執行能力[9-10]。

1.2.2Morris水迷宮實驗：水池被N,E,S,W 4個等分點劃分為：東北NE、東南SE、西北NW和西南SW 4個象限。對應N,E,S,W 4個點同一高度分別粘貼黑色三角形、正方形、圓形、五角星，在SE象限安裝水下隱蔽平臺，水池蓄水至沒過平臺1 cm，使用無毒食用漂白劑將水染成不透明白色液體，混合均勻且穩定后確保平臺不可見。在NW象線池壁上標記一位置，與隱蔽平臺圓心與水池圓心在同一直線上，此位置為實驗小鼠入水點。將小鼠頭朝池壁放入水中，訓練時間90 s，記錄動物找到水下平臺的時間，如果90 s內小鼠未爬上隱蔽平臺，視其潛伏期為90 s，在90 s后停止圖像采集，將小鼠引導至隱蔽平臺上20 s進行學習記憶。每只動物連續訓練5 d，第6天將平臺撤除，開始60 s的探查實驗，記錄動物穿過平臺次數、進入目標象限次數、在目標象限停留時間和游泳距離等作為空間記憶的檢測指標。Morris水迷宮實驗廣泛運用于認知功能障礙及神經退行性疾病(如阿爾茨海默病、帕金森病、精神分裂癥等)行為學研究中，被學界廣泛認可和應用，可以綜合評價小鼠空間學習記憶能力[11]。

1.2.3曠場實驗：設定相關參數和記錄時間(5 min)，實驗在安靜的環境下進行，將小鼠放置在中央格，同時進行攝像和計時，5 min后自動停止攝像。計算機自動記錄運動總距離、平均速度、中央格停留時間和穿格次數等指標。每只動物實驗結束后，清除實驗箱內動物的大小便，用75%乙醇擦洗箱底和四壁，以清除氣味。曠場行為實驗可用來評估實驗動物的自主運動能力和探究行為[12]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 社會隔離對小鼠日常活動執行能力的影響

筑巢結果顯示，對照組群居飼養的C57BL/6小鼠大多數可以撕碎70%以上棉片，巢穴比較完整(圖1A)，社會隔離8周的C57BL/6小鼠大多數可以撕碎50%～70%棉片，巢穴不完整(圖1B)。社會隔離8周的C57BL/6小鼠筑巢得分(2.83±1.01)顯著低于對照組群居飼養的C57BL/6小鼠(3.82±1.13)(圖1C，P<0.01)，說明社會隔離導致C57BL/6小鼠日常活動執行能力下降。

注：A：對照組典型圖；B：隔離組典型圖；C：筑巢得分，*P<0.01Note：A: Typical diagram of control group; B: Typical diagram ofisolation group;C: Nesting score，*P<0.01圖1 筑巢實驗結果Fig.1 Nesting experiment results

2.2 社會隔離對小鼠學習記憶能力的影響

Morris水迷宮結果顯示：在定位航行訓練階段，隨訓練時間的延長，對照組尋找站臺的潛伏期逐漸縮短，隔離組前兩天增加，之后逐漸縮短，兩組動物間比較差異有統計學意義(P<0.05，圖2A)。在探索測試和記憶保留測試階段，與未隔離組(2.00±1.97)相比，隔離組(0.93±2.07)穿過平臺所在區域次數較低，差異有統計學意義(圖2B，P<0.05)。進入目標象限次數隔離組(2.10±2.71)較未隔離組(5.27±2.96)更少，差異極有統計學意義(圖2C，P<0.01)。目標象限停留時間百分比隔離組(14.29±18.31)較未隔離組(27.95±17.14)更低，差異有統計學意義(圖2D，P<0.01)。目標象限游泳距離百分比隔離組(16.05±15.79)較未隔離組(29.55±15.66)更低，差異有統計學意義(圖2E，P<0.01)。兩組典型軌跡圖顯示，對照組穿過平臺所在區域次數較多，表現出多次尋找平臺，相對的社會隔離組小鼠穿過平臺所在區域次數較少，學習記憶效果較差(圖2F)。

注：A：潛伏期；B：穿過平臺所在區域次數；C：進入目標象限次數；D：目標象限停留時間百分比；E：目標象限游泳距離百分比；*P<0.05，**P<0.01;F：典型軌跡圖Note:A: Incubation period; B: Times of passing through the area where the platform is located; C: Number of times to enter the target quadrant; D: Percentage of residence time in target quadrant; E: Percentage of swimming distance in target quadrant;*P<0.05,**P<0.01;F: Typical trajectory diagram圖2 Morris水迷宮實驗結果Fig.2 Morris water maze results

2.3 社會隔離對小鼠自主運動能力和探究行為的影響

曠場結果顯示，隔離組小鼠的運動總路程(26 030±4 629)與對照組(21 575±4 475)相比增加，差異有統計學意義(圖3A，P<0.01)。隔離組小鼠的平均運動速度(86.82±15.39)與對照組(74.10±14.89)相比增加，差異有統計學意義(圖3B，P<0.01)。隔離組小鼠的穿格總次數(108.03±25.14)與對照組(86.33±25.63)相比增加，差異有統計學意義(圖3C，P<0.01)。隔離組小鼠的靜止時間(17.68±7.62)與對照組(25.5±15.54)相比減少，差異有統計學意義(圖3D，P<0.05)。隔離組小鼠在中央區域停留時間(9.57±6.38)與對照組(10.31±6.37)相比，無統計學差異(圖3E)。隔離組小鼠的典型運動軌跡圖與對照組相比更復雜，運動距離更遠(圖3F)。

注：A：總路程；B：平均速度；C：穿格總次數；D：靜止時間；E：中間區域停留時間，*P<0.05，**P<0.01；F：典型運動軌跡Note:A：Total distance；B：Average speed；C：Number of transitions；D：Rest time；E：Intermediate area residence time，*P<0.05，**P<0.01；F：Typical trajectory圖3 曠場實驗結果Fig.3 the open field test

3 討論

實驗用嚙齒類動物是社會性物種，社會互動和組織與生存和繁殖成功密切相關。社會隔離作為一種慢性應激，可以使其產生心理、精神異常。有研究表明，青春期的社會隔離會導致持續的缺陷，包括情緒和認知失調，斷奶后的小鼠社會隔離會導致注意力減少、社會聯系行為受損和條件性恐懼記憶受損[3]；斷奶后單獨飼養8周的小鼠，即使再社會化后，也表現出社會認知缺陷[13]。斷奶后的社會隔離還可以導致長期恐懼記憶的遺忘，這是由于EphB2介導的海馬CA1區突觸功能下調引起的[14]。從青春期到成年早期(產后28～70 d)的小鼠，6周的社會隔離后雌性小鼠在高架迷宮實驗中產生了一種抗焦慮表型，在其他關于回避行為或恐懼條件反射等實驗中沒有影響[15]。有研究表明，隔離飼養的小鼠在曠場行為實驗中表現出多動癥[16]，青春期Wistar雄性大鼠和年輕的成年大鼠在曠場行為實驗中的運動能力也增強[5]。也有研究表明，早期社會隔離降低了雌性ICR小鼠的運動性[17]。通過各種行為測試，大量研究調查了社會隔離飼養對實驗室嚙齒動物學習和記憶能力的影響。大多數研究表明，社會隔離飼養會損害嚙齒類動物學習和記憶，產生社會認知缺陷，然而，證據并不一致。我們認為這可能是因為社會隔離期、動物的物種/種類、性別和發育階段以及所使用的行為任務的不同導致的。

本研究通過筑巢實驗、Morris水迷宮實驗和曠場實驗，對C57BL/6小鼠日常活動執行能力、空間學習記憶能力和在陌生環境中的自主行為與探究行為進行了測試。在筑巢實驗中，社會隔離8周的C57BL/6小鼠筑巢得分顯著低于群居飼養的C57BL/6小鼠，說明社會隔離導致C57BL/6小鼠日常活動執行能力下降。在Morris水迷宮實驗中，本研究發現隨訓練時間的延長，對照組C57BL/6小鼠尋找站臺的潛伏期逐漸縮短，隔離組C57BL/6小鼠前兩天增加，之后逐漸縮短，兩組動物間有顯著差異。與對照組相比，隔離組穿過平臺所在區域次數和進入目標象限次數更少，目標象限停留時間和游泳距離更短，說明社會隔離導致C57BL/6小鼠學習記憶能力下降。在曠場實驗中，與對照組相比，隔離組C57BL/6小鼠的運動總路程、平均速度和穿格總次數增加，靜止時間減少，該結果表明，社會隔離增加了C57BL/6小鼠的自主運動能力和探究行為，可能是因為社會隔離增強了C57BL/6小鼠的焦慮行為。

本研究結果表明，8周齡成年小鼠社會隔離飼養8周會導致日常活動執行能力和空間學習記憶能力下降，對陌生環境中的自主行為與探究行為增強，與對照組相比，均有統計學差異。本研究結果提示，如果實驗中需要使用C57BL/6小鼠進行筑巢、Morris水迷宮或曠場實驗，那么C57BL/6小鼠不適合單籠飼養。單籠飼養C57BL/6小鼠會造成其社會隔離，導致C57BL/6小鼠日常活動執行能力、空間學習記憶和探究行為的變化，影響實驗結果，建議5只左右社會群居飼養。