實驗小鼠與人體內寄生華支睪吸蟲成蟲的對比研究*

劉 柳 張鳳玉 張 靜 張 浩

(齊齊哈爾醫學院病原生物實驗室，齊齊哈爾 161006)

華支睪吸蟲(Clonorchissinensis)是我國重要的食源性寄生蟲之一，在我國分布廣泛。黑龍江省位于中國東北部，有黑龍江、松花江、烏蘇里江流經，河流湖泊眾多，是我國華支睪吸蟲病的重要流行區[1]。黑龍江本地曾有多起肝吸蟲病暴發的記錄，感染病例屢見不鮮[2]。華支睪吸蟲自然感染的宿主較多，除人以外，食魚的鳥類、貓、狗感染較為普遍[3-4]。以往文獻中記載構建動物模型常用兔、犬、貓、貍、大鼠等[5]，小鼠作為華支睪吸蟲感染的動物模型在國內報道較少[6]，小鼠體內與人體中自然感染的華支睪吸蟲的對比尚未見報道。本實驗室前期使用昆明小鼠成功構建了動物模型，為驗證所獲蟲體在小鼠體內發育程度，我們將小鼠感染所獲成蟲標本與本實驗室歷年收集的人體感染成蟲標本加以比較，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1臨床標本：來自附屬醫院肝吸蟲患者手術及膽汁引流物中的送檢蟲體，經鑒定為華支睪吸蟲的標本18只。

1.1.2實驗動物：健康清潔級昆明小鼠 8只，6～8周齡，體質量20～30 g，SPF 級環境喂養，實驗動物由齊齊哈爾醫學院動物倫理委員會批準(倫理批準號QMUAECC-2021-100)，并按照齊齊哈爾醫學院動物倫理委員會批準方案執行。

1.1.3主要儀器與試劑：OLYMPUS CX31RBSF光學顯微鏡(Olympus公司)；Leica光學顯微鏡、Leica體視顯微鏡(Leica公司)；HH-BLL-500型恒溫箱(上海躍進醫療器械廠)；80目標準檢驗篩(浙江上虞市華豐五金儀器有限公司)。胃蛋白酶(北京中生瑞泰科技有限公司)，醋酸洋紅染液(Coolaber公司)。

1.2 方法

1.2.1囊蚴的采集與分離：選取陽性麥穗魚 Pseudorasbora parva，剪碎并采用人工消化法消化12 h[7]。過篩除渣后用清水洗滌并多次沉淀，直至上清液澄清。在體視顯微鏡下將華支睪吸蟲囊蚴匯聚到一起，并用小吸管吸出后保存在阿氏液(檸檬酸0.5 g、檸檬酸鈉8.0 g、葡萄糖20.5 g、氯化鈉4.2 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL)中[7]置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2動物感染：選取8只KM小鼠，抓住小鼠頭部及其后背皮膚，使其頭、頸和身體呈直線。灌胃針頭從小鼠的嘴角進入，壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內推進，進入食道后將存有囊蚴的阿氏液注射至胃，每只灌胃感染35～40只囊蚴。

1.2.3蟲體采集：灌胃感染3周后，隔天收集一次小鼠糞便，采用水洗沉淀法進行檢查，直至在糞便沉淀物中發現蟲卵。采用脫頸法處死小鼠，分離、取出肝膽管和肝臟。剪開膽管，切開肝葉，雙手擠壓使蟲體由肝膽管流出。將擠壓出的蟲體連同肝組織放在盛有0.9%氯化鈉溶液的培養皿內，沉淀2 h后收集沉積于皿底的蟲體。

1.2.4標本制備：獲得的蟲體由10%甲醛溶液進行壓片固定，待蟲體形態穩定后，將其保存在10%甲醛溶液中，固定24 h以上。固定后的蟲體用流水沖洗過夜，洗去其表面固定液。使用醋酸洋紅染 液染色8 h后進行鹽酸乙醇分色、梯度乙醇脫水、透明、封片等步驟[8]。

1.2.5觀察測量：將制備的人體與小鼠內的華支睪吸蟲標本在光學顯微鏡下進行觀察測量。觀測指標包括：蟲體大小；口、腹吸盤直徑；生殖、消化、排泄系統以及蟲卵大小等。

1.3 統計學分析

2 結果

實驗的8只小鼠均感染成功，感染至第15天時小鼠開始出現精神萎靡，腹部逐漸隆起；感染至第23天時在小鼠糞便中檢出蟲卵。剖殺后在小鼠肝膽管獲取成蟲，所獲得的蟲體呈扁平狀，顏色為乳白色半透明，前端狹窄而尖銳，后端較闊而頓。體前端具有口吸盤，體末端具有排泄孔，體中部可見清晰的腹吸盤、子宮、睪丸等內部器官。將蟲體固定并進行醋酸洋紅染色后，觀察發現其各項特征均與文獻中記載的華支睪吸蟲[9]相符。將其與來自臨床的標本觀察比較，結果如下。

2.1 形態比較

2.1.1外部形態比較：華支睪吸蟲成蟲期體形狹長，背腹扁平，前端稍窄，后端鈍圓，形態似葵花子，體表無棘。人體內獲得的華支睪吸蟲較為圓頓(圖1A)，而小鼠體內獲得的華支睪吸蟲較為狹長(圖1B)。口吸盤位于體前側，腹吸盤位于體前約1/4處，口吸盤略大于腹吸盤。

注：A.人體內華支睪吸蟲成蟲(×10)；B.小鼠華支睪吸蟲成蟲(×10)Note: A.Adult Clonorchis sinensis in humans (×10)B.Adult Clonorchis sinensis in mice (×10)圖1 華支睪吸蟲成蟲對比圖Fig.1 Comparison of Clonorchis sinensis

2.1.2生殖系統：雌雄同體，生殖器官發達。睪丸2個呈多分支狀，前后排列于華支睪吸蟲體后部，其長度約占蟲體總長度的1/ 4；兩睪丸各有一條輸精管引出前行，兩條輸精管匯合成儲精囊；受精囊位于睪丸前端，呈不規則橢圓形，受精囊上有一條彎曲的勞氏管；卵巢分3葉，位于睪丸與受精囊前側(圖2A～B)。卵巢引出輸卵管，通向卵膜及迂回子宮；子宮長而彎曲上至腹吸盤前，通于雌性生殖孔，開口于腹吸盤前側，通于雌性生殖孔；卵黃腺分布于蟲體兩側，可見其中充滿卵黃細胞。

2.1.3消化系統：口位于口吸盤中央，由口入為短而圓的咽，咽后通到短細的食道，食道后分為兩只腸管。兩只腸管延長到體后端，末端為封閉的盲管，不匯合，位于排泄囊兩側(圖2C～D)。

2.1.4排泄系統：排泄孔開口于蟲體末端，其上端為排泄囊，呈長管狀(圖2C～D)，排泄物可從其排出體外。

2.1.5蟲卵：蟲卵充盈在子宮內部，呈卵圓形。上端稍窄且有卵蓋，稍隆起，蓋周圍卵殼增厚形成肩峰，卵后端大而圓，有一似結節狀突起(圖2E～F，圖3)。

注：A.人體內華支睪吸蟲卵巢、受精囊(×50);B.小鼠內華支睪吸蟲卵巢、受精囊(×50) ;C.人體內華支睪吸蟲排泄囊、排泄孔、腸支末端(×50);D.小鼠內華支睪吸蟲排泄囊、排泄孔、腸支末端(×50);E.人體內華支睪吸蟲子宮內蟲卵(×100);F.小鼠內華支睪吸蟲子宮內蟲卵(×100)Note: A.C.sinensis ovaries and fertilization vesicles in humans (×50);B.mouse C.sinensis ovaries and fertilization vesicles (×50);C.C.sinensis excretory sacs, excretory holes, and end of intestinalbranches in humans (×50)；D.mouse C.sinensis excretory sac,excretory hole, end of intestinal branch(×50); E.C.sinensisendometrium eggs in human (×100);F.mouse C.sinensis endometrium eggs (×100)圖2 華支睪吸蟲內部結構Fig.2 Internal structure of Clonorchis sinensis

圖3 華支睪吸蟲子宮內蟲卵(×400)Fig.3 Clonorchis sinensis endometrium eggs (×400)

2.2 測量比較

將華支睪吸蟲壓片至最薄最長狀態后進行測量，寄生于人體內的華支睪吸蟲成蟲長為(21.57±5.68)mm，寄生于小鼠體內的華支睪吸蟲成蟲長為(10.22±1.57)mm，差異具有統計學意義(F=25.058，P<0.05)，未壓片前的華支睪吸蟲處于蟲體緊縮狀態，由于各個蟲體的蜷縮程度不同，不利于數據的測量統計，也不利于染色與內部結構的觀察，所以將蟲體進行壓片后進行數據測量。(請討論壓片固定對蟲體大小的影響)；寄生于人體內的華支睪吸蟲寬為(6.29±1.04)mm，寄生于小鼠體內的華支睪吸蟲寬為(3.25±0.14)mm，差異具有統計學意義(F=14.058，P<0.05)。根據數據測量結果(表1)以及SPSS22.0統計軟件分析可知，人體及小鼠內寄生的華支睪吸蟲大小、口吸盤、腹吸盤、咽、子宮、卵巢、受精囊、睪丸以及蟲卵的P值均小于0.05，即可認為人體內和小鼠體內寄生的華支睪吸蟲形態存在明顯差異。

表1 人體內和小鼠內寄生華支睪吸蟲各部位數據比較Table 1 Comparison of data on parasitic of Clonorchissinensis in humans and

3 討論

肝吸蟲病在我國大部分省份都有發生和流行[10]，人體作為華支睪吸蟲終宿主感染較為普遍。以往研究中小鼠作為實驗動物相關報道較少。小鼠價格低廉，方便飼養，對外部環境適應能力強，本實驗通過探究華支睪吸蟲在其體內發育的成熟度，來驗證小鼠是否適合作為華支睪吸蟲的終宿主，對之后華支睪吸蟲動物感染模型的建立具有重要意義。

在本次實驗研究中，KM小鼠感染至23 d即可在糞便中查到蟲卵，與參考文獻[11]報道小鼠的糞便查出蟲卵時間為25 d相近，也與國外報道[12]小鼠感染過程查出糞便時間為17～30 d基本一致。在實驗過程中觀察到，自然狀態下華支睪吸蟲較壓完片后的蟲體大小存在明顯差異。因此在制作華支睪吸蟲標本的過程中，用蓋玻片輕輕擠壓使標本達到最薄最長狀態:其一是為了減少壓片固定對蟲體大小的影響，其二是方便觀察蟲體的內部結構。分析人體及小鼠體內獲得的華支睪吸蟲外部形態觀察到內部結構的測量結果，兩者外部與內部的形態以及蟲卵外觀基本無差異，與參考文獻[13]的研究結果相仿，但兩者的各結構測量數據具有統計學差異。其數據統計結果顯示，寄生于小鼠體內華支睪吸蟲外部與內部結構的測量數據均小于寄生于人體內的華支睪吸蟲，這與參考文獻[14]描述的動物源的成蟲一般都小于人體中寄生的成蟲的觀點較為統一。有研究結果顯示[15-16]，隨著小鼠感染時間的延長，蟲體各部位的長和寬是逐漸增大的，那么繼續延長感染時間，小鼠體內獲得的蟲體是否會繼續增大，人工感染得到的華支睪吸蟲子宮內蟲卵是否也具有像人體中獲得的華支睪吸蟲蟲卵有感染性，值得我們進一步探究。這將作為下一步研究的工作重點。