環(huán)介導等溫擴增技術檢測四翼無刺線蟲方法的建立*

黃 健 馮育芳 邢 進 魏 杰 李曉波 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102629)

四翼無刺線蟲是小鼠常見的體內寄生蟲，是實驗動物蠕蟲檢測項目中陽性率較高的，常造成群體大范圍傳染[1]。因該線蟲與隱匿管狀線蟲形態(tài)特征近似，不易分辨，對日常檢測造成一定困難。目前，該項目常用的檢測方法是依靠形態(tài)學進行顯微鏡肉眼檢測，分子生物學的PCR方法已有報道。但形態(tài)學檢測需要檢測人員經(jīng)過寄生蟲形態(tài)學系統(tǒng)培訓達到一定經(jīng)驗要求，PCR方法需要高技能人員和精密的熱循環(huán)和電泳設備，通常在基層檢測中難以應用[2]。因此，建立一種方便、快捷的檢測方法，對于四翼無刺線蟲的檢測十分有必要。

環(huán)介導等溫擴增方法(loop—mediated isothermal amplification，LAMP)是一種體外核酸擴增技術[3]，可作為PCR的另一種替代方法，依靠識別目標序列中特定的6個區(qū)域，設計內部引物(FIP、BIP)和外部引物(F3、B3)[4]。此外，LAMP檢測不需要昂貴的熱循環(huán)設備，僅在恒溫條件下進行擴增[5]，即可進行簡單的視覺檢測對結果進行驗證，特異性和敏感性強，效率高、擴增速度快。現(xiàn)已應用于病原微生物的日常檢測中[6]。

本研究針對四翼無刺線蟲設計一種基于環(huán)介導等溫擴增方法對基因組DNA進行檢測，目的是能為基層實驗室提供一種快速診斷的新方法。

1 材料和方法

1.1 實驗樣本

四翼無刺線蟲和鞭毛蟲樣本均來自本實驗室日常檢測的實驗動物，以實驗動物使用的“3R”原則為依據(jù)，經(jīng)安樂死處死后，取腸內容物收集四翼無刺線蟲和鞭毛蟲樣本。

1.2 主要試劑與儀器

微量基因組DNA、糞便DNA提取試劑盒(OMEGA公司)；DNA Marker、瓊脂糖、RNase-free Water(TaKaRa公司)；DNA-LAMP擴增反應試劑盒、LAMP熒光檢測試劑盒【榮研生物科技(中國)有限公司】。

1.3 基因組DNA的提取

四翼無刺線蟲基因組DNA：取單條蟲體，按試劑盒說明提取DNA，保存于-20 ℃冰箱。鞭毛蟲基因組DNA：取少于2 mg的糞便，按試劑盒說明提取DNA，同樣保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.4 LAMP擴增反應方法建立

1.4.1LAMP引物設計和合成：參照NCBI GenBank中四翼無刺線蟲398 bp DNA序列(登錄號MG386202.1)，使用在線軟件PrimerExplorer V5 設計LAMP引物，F(xiàn)IP:5’-CCTTAATACCAGTAGGAAC AGCAATTTTTGATATGAGGACTCGTTTG-3’，BIP：5’-TGGTAGTAATATGGTGTTTCAGCCTAATACCAGTTAAA CCCCCTAA-3’，F(xiàn)3：5’-GGTCATCATATGTTTACTGT GG-3’，B3：5’-CCAAAACAGGA TTAGCAACC-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2LAMP反應體系及結果判定：25 μL LAMP反應體系為：2×反應液(含40 mmol Tris-HCL，pH 8.8)，20 mmol KCL，16 mmol MgSO4，20 mmol (NH4)2SO4，0.2% Tween20，125 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，100 μmol內引物FIP和BIP各0.4 μL，100 μmol外引物F3和B3各0.1 μL，Loopamp熒光目測檢測試劑(FD)1 μL，模板DNA 2 μL，加RNase-free Water至25 μL。移液器吹打混勻后，放入恒溫金屬浴62 ℃恒溫反應60 min，最后80 ℃滅活5 min。取出觀察有無顏色變化，當發(fā)生擴增反應時，呈綠色為陽性反應，橙色為陰性反應。取2 μL LAMP擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 特異性實驗

應用試劑盒提取四翼無刺線蟲和鞭毛蟲基因組DNA，分別對四翼無刺線蟲和鞭毛蟲基因組DNA、ddH20進行LAMP擴增實驗，觀察熒光顯色情況和對LAMP擴增產(chǎn)物進行電泳，觀察擴增結果。

1.6 敏感性實驗

將四翼無刺線蟲基因組DNA以 10倍梯度稀釋，分別為2.8～2.8×105ng/μL共6個梯度。取2 μL DNA加入LAMP反應體系，進行LAMP擴增反應。

2 結果

2.1 LAMP檢測結果

四翼無刺線蟲DNA擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色(陽性)，電泳后出現(xiàn)特征性的梯度條帶。對照反應管為棕色(陰性)，電泳未顯示條帶。

2.2 LAMP反應特異性驗證

特異性實驗結果見圖1，只有四翼無刺線蟲基因組DNA的LAMP產(chǎn)物呈現(xiàn)強烈的綠色，ddH2O和鞭毛蟲基因組DNA出現(xiàn)棕色。擴增后產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，四翼無刺線蟲基因組DNA可擴增出典型梯度條帶，其余對照均未出現(xiàn)條帶(圖2)。

1.鞭毛蟲；2.水；3.四翼無刺線蟲1.Giardia lamblia;2.ddH2O;3.aspiculuris tetraptera圖1 特異性實驗結果Fig.1 The specificity test

M.100 bp DNA Ladder Marker；1.四翼無刺線蟲；2.鞭毛蟲；3.水M.100 bp DNA Ladder Marker；1.Aspiculuris tetraptera；2.Giardia lamblia；3.ddH2O圖2 LAMP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果(特異性)Fig.2 Results of LAMP amplification products byAgarose gel electrophoresis(specificity test)

2.3 LAMP反應敏感性驗證

將四翼無刺線蟲DNA模板10倍梯度稀釋10～105倍共5個濃度，LAMP擴增產(chǎn)物的綠色熒光顯示，LAMP反應的擴增水平可擴增出102倍的稀釋DNA(圖3)，與瓊脂糖凝膠電泳結果一致(圖4)。

1～6.原液～105倍稀釋；7.鞭毛蟲；8.水1～6.Crude solution～105 times dilution;7.Giardia lamblia;8.ddH2O圖3 敏感性實驗結果Fig.3 The sensibility test

M.100 bp DNA Ladder Marker；1～6.原液～105倍稀釋；7.鞭毛蟲；8.水M.100 bp DNA Ladder Marker;1-6.Crude solution-105times dilution;7.Giardia lamblia;8.ddH2O圖4 梯度稀釋DNA LAMP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果(敏感性)Fig.4 Results of LAMP amplification products byGradient dilution of DNA (sensibility test)

3 討論

四翼無刺線蟲(Aspiculuristetraptera)是蠕蟲的一種，屬于線蟲綱(Nematoda)，尖尾目(Oxyurida)，異線科(Heteroxynematidae), 無刺屬(AspiculurisSchulz)，又稱蟯蟲[7]。該種線蟲在全球各地均有報道，并且在實驗室的實驗鼠中經(jīng)常被檢測到，在中國《實驗動物 寄生蟲學等級及監(jiān)測》國家標準(GB 14922.1—2001)和其他國實驗動物檢測標準中，均是應排除的寄生蟲之一。實驗鼠感染蟯蟲后，對實驗的準確性和可靠性將會產(chǎn)生影響，因此必須對鼠蟯蟲病的篩查給予重視。

目前，四翼無刺線蟲常用的檢測方法是依靠形態(tài)學進行顯微鏡肉眼檢測，PCR方法已有報道。但形態(tài)學檢測需要檢測人員經(jīng)過寄生蟲形態(tài)學系統(tǒng)培訓達到一定經(jīng)驗要求，PCR方法需要高技能人員和精密的熱循環(huán)和電泳設備，實驗結果假陽性較高[8]。與傳統(tǒng)PCR檢測法相比，LAMP檢測法操作簡便，因其為等溫反應，可省去熱循環(huán)擴增，不需要PCR儀，操作極為簡便[9]；耗時短，LAMP反應體系可在恒溫條件下擴增，僅耗時1 h左右，即可根據(jù)肉眼觀察的綠色熒光情況對LAMP產(chǎn)物的擴增情況進行結果判定，其擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，出現(xiàn)特征性的階梯狀條帶，不會出現(xiàn)雜帶而干擾結果的判斷；經(jīng)過熒光顯色法和瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果一致，因此，可選用熒光顯色法作為LAMP法的結果判定。可避免因開蓋電泳造成污染形成的假陽性結果[4]。

可見，四翼無刺線蟲的LAMP擴增反應具有簡便、快速、特異性強、靈敏度高的特點。作為一種快速診斷的新方法為基層實驗室和現(xiàn)場檢測工作提供新的檢測參考依據(jù)，為四翼無刺線蟲的檢測提供了一種新思路和新方法。