骨關節炎的基因治療研究進展

許 航 孟 林

·綜述與進展·

骨關節炎的基因治療研究進展

許 航1孟 林2

1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院創傷骨科與手外科，廣西南寧 530011; 2.廣西骨傷醫院關節科，廣西南寧 530012

骨關節炎是一種嚴重影響人們生活質量的骨科疾病，盡管治療手段較多，但治療效果仍然欠佳。近幾年，隨著基因治療在骨關節炎方面的研究逐步深入，發現其可以通過抑制炎癥、抑制軟骨細胞凋亡，以及促進軟骨細胞增殖等途徑發揮重要作用，具有廣闊的應用前景。本文結合近年來國內外相關研究文獻，對骨關節炎基因治療的研究現狀進行總結分析，為后續相關研究提供參考。

骨關節炎；基因治療；載體

骨關節炎是一種多見于中老年人及運動員的疾病，臨床表現為病變關節疼痛、僵硬、腫脹、功能下降，發作過程為持續性及反復性[1]。近年來，隨著分子生物學的飛速發展，基因治療逐漸成為骨關節炎治療的熱點。骨關節炎的基因治療是指將具有編碼治療性蛋白的基因導入關節中，使關節組織持續形成具有治療骨關節炎的蛋白，從而達到治療骨關節炎的目的。本文廣泛查閱近年來國內外有關骨關節炎基因治療的相關研究，并進行總結分析，旨在為骨關節炎的基因治療后續相關研究提供參考和借鑒。

1 炎癥因子在骨關節炎中的作用

骨關節炎的發病機制尚不完全清楚，目前認為骨關節炎的發病主要涉及致病因素刺激關節組織表達腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（inter-leukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥因子[2]。相關研究表明，TNF-α和IL-1β對于金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和聚蛋白多糖酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-motifs，ADAMTS）的產生起著重要的調節作用，MMPs和ADAMTS均是降解酶，可誘導軟骨降解[3]。在TNF-α、IL-1β等炎癥因子的作用下，核轉錄因子κB（nu-clearfactor κB，NF-κB）被激活，然后引起內皮細胞釋放MMPs，通過旁分泌方式來影響軟骨細胞功能，最后通過降解軟骨的方式來加速骨關節炎的病理進展，也就是說激活NF-κB通路，誘發關節軟骨破壞[4]。IL-1β還可促進軟骨細胞和滑膜細胞合成并釋放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）產生強大的致痛作用[5]。此外，活化的炎癥細胞會產生、累積并釋放活性氧，啟動氧化應激，進而促進MMPs釋放，加速軟骨細胞凋亡[6,7]。一般認為TNF-α和IL-1β等炎癥因子主要通過調節NF-κB信號通路來影響關節軟骨降解。但研究發現，還有許多信號通路與關節炎癥相關，提示當阻斷NF-κB信號通路時，炎癥細胞因子也可通過其他通路釋放各種炎性介質誘導軟骨破壞[8]。

2 信號通路在骨關節炎中的作用

研究表明，骨關節炎發生、發展中重要的信號通路包括NF-κB信號通路、MAPK信號通路、Notch信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等。NF-κB信號通路是重要的炎癥通路，可以被多種炎癥因子激活，啟動炎癥級聯反應，促使細胞釋放大量金屬蛋白酶、氧化酶和致痛因子，加速軟骨基質的分解及軟骨細胞的凋亡[9]。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）信號通路在調控軟骨細胞的增殖凋亡和炎癥方面發揮重要作用，可被細胞炎癥因子激活，將細胞外信號傳至核內，啟動相關基因的表達。Notch信號通路是一條進化高度保守的信號通路，其下游調節基因Hes1可以誘導炎癥因子表達，加速軟骨降解[10]。但也有研究顯示，激活Notch信號通路可使MMPs的表達下調，表明Notch信號通路在骨關節炎發生發展中起重要作用[11]。Wnt/β-catenin信號通路是經典的Wnt信號通路，其中Wnt是一種糖蛋白，可激活下游效應因子β-catenin。Wnt/β-catenin信號通路被激活后可引起軟骨細胞損傷，促進骨關節炎的進展。信號通路已成為骨關節炎近年來的熱點，堅信隨著越來越多因子和通路的作用機制逐步明確。必會給骨關節炎的防治帶來革命性的突破。

3 骨關節炎基因治療相關載體

3.1 腺病毒載體

腺病毒（adenovims）為DNA病毒，它可以感染各時相的細胞，不易與宿主基因發生整和，故被廣泛應用于研究。但其缺點是表達時間短、容量小，使用其作為載體可能在體內引起免疫應答，第三代腺病毒載體的產生解決了上述問題。Nixon等[12]采用小鼠和馬動物模型，首先體外構建白介素-1受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Rα）輔助依賴性腺病毒載體，關節腔注入輔助依賴腺病毒白介素-1受體拮抗劑（helper-dependent adenovirus- interleukin-1 receptor antagonist，HDAd- IL-1Ra）后，組織學檢測表明IL-1Ra基因轉導后明顯減輕了滑膜的炎癥，減少了關節軟骨的損傷，說明IL-1Ra基因治療是治療關節滑膜炎癥反應的一種可行的方法。Farrell等[13]體外將攜帶病毒白介素-10（virus- interleukin-10，vIL-10）靶基因的復制缺乏型腺病毒載體（adenovirus- interleukin-10，AdvIL-10）轉染至人間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC），AdvIL-10轉染的MSC與脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞共同培養后，ELISA法檢測表明巨噬細胞的TNF-α生成下降，說明vIL-10基因轉染后可以抑制炎癥。

3.2 腺相關病毒載體

腺相關病毒（adeno-associated vires，AAV）是一種DNA病毒，其物理性質穩定，能感染非增殖及增殖細胞，使用腺相關病毒作為基因載體很少在體內引起免疫應答反應，對人不致病，具有較高的安全性。但在實際運用上，AAV可攜帶目的基因的容量小，感染滴度低，對目的基因的選擇有一定限制。Hemphill等[14]體外實驗將表達胰島素樣生長因子Ⅰ（insulin-like growth factor Ⅰ，IGF-Ⅰ）基因的自身互補腺相關病毒載體（self-complimentary adeno-associated virus-IGF-Ⅰ，scAAVIGF-Ⅰ）轉染馬關節軟骨細胞，7d后取出標本可以發現IGF-Ⅰ表達提高，同時也明顯促進了Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的合成，說明scAAVIGF-Ⅰ具有較強的誘導軟骨修復的能力。Watson Levings等[15]實驗研究發現，自身互補腺相關病毒載體介導的IL-1Ra轉染后，能在馬腕關節持續產生IL-1Ra、PGE2濃度明顯下降，組織學和影像學顯示滑膜炎和軟骨損壞得到改善。Rey-Rico等[16]應用組織工程技術，將攜帶人的TGF-β靶基因的重組腺相關病毒載體（adeno- associated virus-human TGF-β，rAVV-hTGF-β），該聚合物膠束是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯在水中自組裝形成的一種膠體溶液，可以與藥物相溶解，增加了藥物的代謝穩定性和體內循環時間，也被認為是一種較好的藥物輸送載體[17]。人骨關節炎軟骨細胞與含有rAAV-hTGF-β的聚合物膠束共孵育后，ELISA法測定發現TGF-β表達水平明顯比自由載體組高。人軟骨缺損培養物與重組腺相關病毒/聚合物膠束共孵育，發現軟骨細胞數量明顯增加，Ⅱ型膠原蛋白沉積也更多，說明組織工程技術與基因治療聯合應用在提高目的基因的表達、延長目的基因的表達時間、延緩骨關節炎進展方面具有較大優勢。

3.3 慢病毒載體

慢病毒（lentivirus，LV）為RNA病毒，其攜帶的遺傳物質為RNA而不是DNA，是以人類免疫缺陷病毒1型為基礎發展起來的基因治療載體，能感染增殖及非增殖細胞，其免疫性小，感染效率高，容納外源性目的基因片段大，感染滴度高，可長時間穩定表達，是轉基因技術的主要載體之一。但不利的是慢病毒可以插入到宿主的基因組中，可能引起宿主基因突變而致瘤[18]。Zhang等[19]應用基因重組技術，將環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）沉默基因、聚集蛋白聚糖酶-1（aggrecanse-1）沉默基因和IGF-Ⅰ的表達基因重組到慢病毒載體中，產生的重組慢病毒感染人骨髓干細胞，7d后RT-PCR檢測表明COX-2和aggrecanse-1的mRNA表達明顯下降，IGF-Ⅰ的mRNA表達明顯上升。在猴交叉韌帶切除骨關節炎模型中重組慢病毒感染人骨髓干細胞注射至目標關節，7d后提取關節滑液可以發現IGF-Ⅰ濃度明顯升高，炎癥因子IL-1和致痛因子PGE2的濃度明顯降低，組織學檢測也表明COX-2沉默基因、aggrecanse-1沉默基因和IGF-Ⅰ表達基因轉導后，避免骨膠原的丟失，促進了關節軟骨的合成。Gabner等[20]實驗研究證實了慢病毒介導的IL-1Ra基因轉染后，可明顯降低馬軟骨細胞的IL-1β、IL-6、MMPs水平，說明IL-1Ra基因治療是抑制炎癥反應的一種有效的方法。

3.4 非病毒載體

由于病毒載體在基因治療過程中有較多缺點，如免疫原性、致癌作用、基因攜帶量較有限和病毒載體不能大規模生產等缺點，因此人們開始重視非病毒載體[21]。相比之下，非病毒載體免疫源性低，生物安全性高，基因攜帶量大，制備簡單，易于保存，但低轉染效率和轉染后基因表達時間短很大程度上限制其廣泛使用[22]。目前常用的非病毒載體有陽離子脂質體、陽離子聚合物、化學聚合物、質粒DNA、納米顆粒等。Jeong等[23]采用一種細胞核靶向聚乙烯亞胺-地塞米松聚合物作為基因遞送系統用于骨關節炎治療的研究，將聚乙烯亞胺-地塞米松聚合物與含有軟骨誘導因子性別決定區域Y相關高遷移率組框6（sex-determining region y-related high- mobility-group box 6，SOX6）和性別決定區域Y相關高遷移率組框9（sex-determining region y-related high-mobility-group box 9，SOX9）、血管生成素樣蛋白4短發夾RNA（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4shRNA）的微型環狀DNA質粒（mini circle DNA）載體復合形成MC-9/6/shANG。研究表明，遞送MC-9/6/shANG至MSC和脂肪干細胞（adipose- derived stem cells，ADSC）后均明顯增加了SOX6和SOX9的表達，同時降低了脂肪干細胞ANGPTL4的表達。手術誘導骨關節炎大鼠體內結果顯示，MC-9/6/shANG-tADSC轉染后的滑液中COX-2和MMP13明顯低于MC-9/6-tADSC組。在骨關節炎大鼠模型中關節內注射MC-9/6/shANG可延緩骨關節炎進展。Watkins等[24]通過將負載白介素-10（interleukin- 10，IL-10）基因的DNA質粒注入骨關節炎動物的關節內，能使IL-10在動物體內得到長效表達而產生抗炎效應且沒顯示明顯不良反應，為開展表達IL-10的DNA質粒治療骨關節炎的臨床研究提供了理論基礎。Rim等[25]采用大鼠動物模型，首先體外構建分別攜帶BMP2和TGF-β3的minicircle DNA質粒載體，在體外轉導至由人誘導多功能干細胞衍生的MSC中，分別在細胞團塊培養基中培養，30d后分別將培養基中的生成的軟骨形成顆粒，植入到大鼠股骨髁的軟骨缺損中。8周后取出標本后發現，在mcTGF-β3顆粒植入關節中的Ⅱ型膠原蛋白表達最高，mcBMP2顆粒植入關節中的Ⅰ和Ⅹ型膠原蛋白表達最高,均成功地填充了Ⅱ膠原蛋白的缺損區域。且研究還發現，mcBMP2轉染率偏低，也就是說雖然mcBMP2轉染少量細胞卻分泌了較高水平的軟骨生長因子。

3.5 非編碼RNA

非編碼RNA可能會影響骨關節炎的發生和發展，其中包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長非編碼RNA（lncRNA）、環狀RNA（circRNA）和小核仁RNA（snoRNA），雖然不編碼蛋白質，但仍會影響基因表達。miRNA調節轉錄后基因的表達，在軟骨細胞增殖凋亡、軟骨外基質代謝、炎癥反應中起重要作用。研究發現，miRNA-27a-3p的上調可能抑制軟骨細胞中MAPK和NF-κB信號通路并最終減少ADAMTS-5的生成[26]。骨關節炎的體內外模型顯示，miRNA影響關節軟骨分解代謝的調節，但并非所有miRNA對骨關節炎均有正性保護作用，研究顯示，在人類骨關節炎模型中，miR-138-5p、miR-146a-5p、miR-335-5p和miR-9-5p的表達均明顯升高[27]。最近在骨關節炎組織中確定了一種新型的miR-4303靶標Asporin（ASPN）[28]，其通過與各種生長因子結合降低其活性，影響軟骨的代謝，最終導致發生骨關節炎[29]，因此，miRNA可作為潛在的輔助診斷標志物，用于追蹤骨關節炎的病程，血清miRNA水平可作為骨關節炎早期診斷的敏感標志物，有望成為骨關節炎早期診斷的新靶標。

另一種非編碼RNA-lncRNA已成為骨關節炎發病機制的重要調控分子。研究表明，在骨關節炎的軟骨細胞中，lncRNA H19表達上調，并下調miR-140-5p表達，從而促進骨關節炎炎癥和軟骨降解的發展[30]。另有研究顯示[31]，高表達的LncRNA MALAT1可通過充當“miRNA分子海綿”降低miR-150-5p有效性，干擾miR-150-5p介導靶基因AKT3下調，進而誘導軟骨細胞凋亡。以上結果提示，在骨關節炎中lncRNA的部分促損傷作用可能是通過負向調控miRNA而實現，兩者可作為骨關節炎治療的靶標，非編碼RNA參與基因表達，表明其可作為骨關節炎基因治療的新靶點。

4 骨關節炎基因治療的臨床試驗

2017年7月，首個骨關節炎基因治療產品Invossa在韓國問世[32,33]。目前，Invossa的Ⅲ期臨床試驗已在美國得以重啟。在近期一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，4例手骨關節炎患者被導入負載干擾素的AVV載體，其中3例患者不能耐受不良反應而中途退出[34]。另一項Ⅰ期臨床試驗共納入9例膝骨關節炎患者，將負載IL-1Ra的AAV載體導入所有的患者后，沒有嚴重的不良反應發生，證明其治療骨關節炎具有一定的臨床可行性和安全性。

5 總結與展望

骨關節炎是嚴重影響中老年人生活質量的一種退行性疾病，目前臨床上還沒有用于有效預防及根治骨關節炎的藥物。基因治療可以延緩關節炎癥并修復軟骨，但仍存在許多未解決的問題。相信隨著分子生物學和組織工程學等相關學科的發展，骨關節炎的基因治療一定會顯現出更加光明的應用前景。

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廣西壯族自治區青年岐黃學者培養項目（桂中醫藥科教發[2022]13號）；廣西中醫藥大學一流學科建設開放課題（2019XK026）

孟林，電子信箱：14262618@qq.com

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