甘草瀉心湯治療潰瘍性結腸炎作用機制研究進展

賈文君 杜錦輝

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC),是由免疫介導的慢性及復發性腸道炎癥。 UC 的病因及發病機制至今尚未明確,目前普遍認為是遺傳、環境、免疫、腸道微生態、黏膜屏障等多種因素的綜合作用所致[1]。 現階段無根治手段,主要以控制炎癥,誘導維持臨床緩解,促進黏膜愈和、預防并發癥為主。中醫學沒有UC 病名的論述,根據腹痛、腹瀉、便血及黏液膿血便等臨床特點,將其歸屬于“泄瀉”“久痢”“腸澼”等范疇[2]。 UC 病機復雜,屬本虛標實之病。 虛為脾氣虧虛,實為濕、熱、瘀、毒,氣血凝滯[3]。 UC 辨證可分為濕熱內蘊證、脾胃虛弱證、脾腎陽虛證、肝郁脾虛證、陰血虧虛證、氣滯血瘀證等證型[4],以濕熱內蘊證和脾胃虛弱證多見[5-6]。 甘草瀉心湯出自于《傷寒論》,主要用于表邪誤下損傷脾胃后形成的寒熱互結之痞證,出現腸鳴、下利頻數,水谷不化、或見干嘔等癥狀[7],與UC 的濕熱蘊結、脾胃虛弱的病機相符合。 在中醫辨證論治思想的指導下,將甘草瀉心湯應用于治療UC 取得了顯著的療效。 實驗研究發現甘草瀉心湯治療UC 具有修復腸道黏膜屏障、調節免疫系統、調節腸道菌群等藥理作用。

1 修復腸道黏膜屏障

UC 的發病機制十分復雜,是遺傳因素、環境因素、免疫反應、腸道微生物等多種因素相互作用的結果。 環境因素、感染因素作用于遺傳易感人群,腸黏膜局部屏障功能受損,腸黏膜屏障通透性增加, 致病菌或腸道正常菌群及其代謝產物侵入腸黏膜上皮, 誘發免疫屏障紊亂[8]。

1.1 促進緊密連接蛋白表達

腸道黏膜屏障主要由腸上皮細胞、腸黏液層、腸道菌群、分泌性免疫球蛋白(secretory immunoglobulin A, sIgA)、腸道相關淋巴組織等共同組成。 UC 的腸黏膜損傷與緊密連接蛋白密切相關,緊密連接蛋白(claudin)是機械屏障最重要的組成部分,其表達的變化反應了腸道機械黏膜屏障的變化。

武曉琳等[9]發現通過免疫組化、蛋白質印跡法和實時 PCR 方法檢測惡唑酮誘導的 UC 大鼠claudin-1、claudin-4 mRNA 和蛋白表達,結果顯示claudin-1、claudin-4 表達顯著下著降低,claudin-2 mRNA 和蛋白表達顯著增高,可能是導致腸黏膜機械屏障功能受損的重要機制之一。 陳浩等[10-11]在動物實驗中分別予TNBS/乙醇法造模后的UC模型大鼠生理鹽水、美沙拉嗪及甘草瀉心湯低、中、高劑量灌胃,14 天后發現與給予生理鹽水的造模組相比,美沙拉嗪及甘草瀉心湯各劑量組結腸組織 claudin-1 蛋白和 mRNA 表達均明顯增高(P<0.01),同時改善UC 模型大鼠的癥狀,以甘草瀉心湯中劑量效果明顯,表明甘草瀉心湯可能通過促進claudin-1 蛋白和mRNA 表達修復腸道黏膜屏障。

腸上皮緊密連接蛋白在腸道黏膜屏障中發揮著細胞間連接的重要作用,UC 通過降低封閉性緊密連接蛋的表達,同時促進滲漏性緊密連接蛋白表達,使腸上皮通透性降低,損傷腸道屏障,claudin 含量隨病變加重而波動,可成為判斷UC 病情嚴重程度的指標和潛在的治療靶點。 實驗研究也發現甘草瀉心湯可促進claudin-1 蛋白和mRNA 表達,可繼續研究甘草瀉心湯對緊密連接蛋白復合體的影響,進一步探討甘草瀉心湯修復腸道黏膜屏障的機制。

1.2 促進分泌型免疫球蛋白A 表達

sIgA 主要來源于腸黏膜固有層的漿細胞,主要存在于呼吸道、消化道、泌尿生殖道等黏膜表面,參與局部黏膜免疫,對胃腸道及呼吸道黏膜均具有保護作用,是維持腸道免疫屏障的重要調節因子[12]。

石濤等[13]以免疫組化法檢測輕、中、重度UC患者腸黏膜組織的咬合蛋白(occludin)、分泌型免疫球蛋白 A(sIgA)和 β 防御素(β-defensin)的表達,觀察腸道機械屏障、免疫屏障和化學屏障功能的變化,發現UC 患者的occludin 和sIgA 在腸道上皮表達下降,隨著臨床分級增加,腸道機械屏障、化學屏障損傷更加明顯。 孫慧怡等[14]通過建立UC 大鼠模型發現與正常組大鼠相比,UC 大鼠結腸及肺組織中s-IgA 表達顯著升高(P<0.05),結腸組織中白細胞介素4(interleukin 4,IL-4)表達顯著升高(P<0.05)。 郭佳裕等[15]觀察甘草瀉心湯對抗生素誘導腸道菌群失調小鼠sIgA 表達的影響,發現甘草瀉心湯低、中、高劑量組和思連康組均能促進腸道內sIgA 的表達,且甘草瀉心湯療效優于思連康,證實了甘草瀉心湯可通過促進腸道sIgA 的表達從而促進腸道黏膜修復。

sIgA 是反應腸道免疫屏障功能的重要指標,現階段的實驗初步證實了在光鏡觀察下甘草瀉心湯對小鼠腸道內sIgA 有一定的促進作用,但目前基于sIgA 變化探究甘草瀉心湯對UC 影響的實驗,仍需進一步研究。

1.3 減少腸上皮細胞凋亡

近年來研究發現UC 存在結腸黏膜上皮細胞凋亡加速的病理特點,腸上皮細胞過度凋亡導致腸黏膜屏障損傷是引起 UC 發生發展的重要環節之一[16-17]。 沈雁等[18]基于 PERK-elF2α-CHOP 信號通路進行細胞實驗和動物實驗研究甘草瀉心湯保護UC 腸黏膜屏障的機制。 在細胞實驗中UC 模型組的細胞存活率(46.88±6.09)% 顯著低于正常組(97.16±4.21)%,細胞凋亡率(29.95±2.16)% 顯著高于正常組(3.13±0.28)%,甘草瀉心湯組的細胞存活率顯著上升、凋亡率均顯著降低,且G2 期細胞比例均顯著升高(P<0.01);甘草瀉心湯中、高劑量組蛋白激酶R 樣內質網激酶(R-like ER Kinase,PERK)、真核細胞起始因子2α(p-elF2α)、轉錄活化因子4(the activating transcription factor 4,ATF4)和C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)水平均顯著降低(P<0.01)。 在動物實驗中甘草瀉心湯低、中、高劑量組的損傷指數、結腸上皮凋亡細胞數、血清D-乳酸(D-lactic acid,D-LAC)和二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)含量均顯著減少(P<0.05,P<0.01),組織中 p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白和凋亡蛋白Bax 的水平均顯著降低(P<0.05,P<0.01),凋亡蛋白Bcl-2 的水平均顯著升高(P<0.01)。 證實了甘草瀉心湯治療UC 的部分機制是通過抑制PERK-eIF2α-CHOP 凋亡信號通路的激活,減少腸上皮細胞凋亡、降低腸上皮通透性,保護腸黏膜屏障。

腸上皮細胞是腸道黏膜屏障的主要結構和功能基礎,腸上皮細胞發生過度凋亡,引起腸道屏障結構受損,腸上皮通透性增加,外源性致病菌或腸道正常菌群及其代謝產物侵入腸黏膜上皮,引發一系列炎癥反應。 體外細胞實驗和動物實驗均發現UC 存在腸上皮細胞過度凋亡的現象,甘草瀉心湯可抑制PERK-eIF2α-CHOP 凋亡信號通路的激活從而控制腸上皮細胞凋亡,但甘草瀉心湯是否能夠影響其他凋亡通路仍需要繼續深入地研究。

2 調節免疫系統

UC 病變主要表現為腸黏膜過度免疫細胞浸潤和組織破壞,從側面反映出免疫因素是UC 發生、發展的關鍵所在[19-20]。 腸道免疫功能主要依靠黏膜免疫屏障、免疫細胞及免疫分子[21]。 正常情況下,輔助性 T 細胞(help T cell,Th)、抑制性 T 細胞(regulatory T cell,Treg)和細胞毒性T 細胞(cytotoxic T cell,Tc)在腸黏膜中出于平衡狀態。 以往認為UC以Th2 介導為主[22],近年來研究發現UC 患者腸黏膜炎癥組織中可檢測出Th17、Treg 細胞的聚集[23]發揮促炎作用。 白細胞介素(interleukin,IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、干擾素(interferon,IFN)和轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)等細胞因子分泌失衡也與UC 關系密切。 在腸道中,免疫系統的促炎和修復信號之間的平衡對于維持腸穩態是必不可少的。 相關信號通路的異常激活可釋放大量炎性因子、免疫因子、趨化因子,從而引起免疫炎癥反應,損傷腸道。 目前已知 TLRs/NF-κB、 IL-6/NF-κB/STAT3、 Th17/Treg等信號通路與UC 相關[24]。

2.1 抑制 TLR4/NF-κB 信號通路

TOLL 樣受體(toll-like receptors,TLRs)是固有免疫中關鍵的模式識別受體,參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[25]。 核因子 κB (nuclear factor-κB,NF-κB)是一種核轉錄因子,調控眾多下游細胞因子(尤其是促炎因子)和相關酶類等[26]。 TLR4 與銜接分子髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor88,MyD88)相識別,從而激活 NF-κB 下游調節因子,使腸黏膜屏障缺血受損導致腸道細菌、內毒素移位,進而誘導大量炎性因子釋放,引發炎癥反應[27]。

陳儀等[28-31]應用2,4-二硝基氯苯聯合乙酸誘導建立UC 大鼠模型,研究甘草瀉心湯干預UC 模型大鼠急性炎癥過程和對TLR4/NF-κB 信號通路的調節作用,實驗將雄性Wistar 大鼠隨機分為空白組、模型組、柳氮磺胺砒啶組、甘草瀉心湯高、中、低劑量組,造模后予柳氮磺胺砒啶組和甘草瀉心湯各劑量組大鼠藥物灌胃治療,大鼠一般情況、疾病指數、結腸組織黏膜病理形態均較模型組有明顯改善,其中甘草瀉心湯高劑量組的疾病指數低于柳氮磺胺砒啶組(P<0.05)。 與模型組相比,各治療組血清IL-1β、 IL-6、 IL-8、 TNF-α 濃 度 低, IL-10 濃 度 高(P<0.05)。 甘草瀉心湯高劑量組與柳氮磺胺砒啶組的差異具有統計學意義(P<0.05)。 各治療組大鼠 結 腸 組 織 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65、 I-κB(inhibitor of NF-κB) 蛋白表達水平、TLR4、NF-κB p65、MyD88 mRNA 轉錄表達水平均顯著低于模型組。 王作玉[32]應用葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立UC 小鼠模型,探究甘草瀉心湯對UC 小鼠 TLRs/NF-kB信號轉導通路中相關蛋白的影響,發現甘草瀉心湯可抑制 TLR4、MyD88 蛋白表達,促進 β-arrestin (抑制蛋白)生成,其中甘草瀉心湯高劑量組效果更明顯。

2.2 抑制IL-6/STAT3 信號通路

IL-6 與靶細胞表面受體(soluble interleukin-6 receptor,sIL-6R)結合,形成 sIL-6R/IL-6 復合物,活化細胞膜表面的糖蛋白130 (glycoprotein 130,gp130),gp130 受到刺激形成同源二聚體,進一步激活與gp130 相關聯的兩面神激酶(Janus kinase,JAK), 并與信號轉導轉錄因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)蛋白結合, 使STAT3 磷酸化后激活 NF-κB,發揮促炎作用[33]。 陳浩等[11,34]以TNBS/乙醇法造模UC 大鼠模型,造模成功后分別以生理鹽水、美沙拉嗪及甘草瀉心湯各劑量予模型組、美沙拉嗪組、甘草瀉心湯低、中、高劑量組灌胃,14 天后以免疫組化方法分析結腸組織IL-6、STAT3 及磷酸化 STAT3 的蛋白表達, 以 qPCR法檢測結腸組織 IL-6 及STAT3 的 mRNA 表達。 研究甘草瀉心湯對UC 模型大鼠的療效和IL-6/STAT3信號通路中相關分子的調節作用。 結果顯示美沙拉嗪組及甘草瀉心湯各劑量組UC 模型大鼠結腸組織IL-6、STAT3、磷酸化 STAT3 的蛋白表達明顯降低,美沙拉嗪組及甘草瀉心湯各劑量組的IL-6 表達無明顯差異,中劑量組的STAT3 表達、高劑量組的磷酸化STAT3 顯著低于美沙拉嗪組。 各治療組給藥后與模型組比較,IL-6、STAT3 mRNA 表達水平均明顯下降(P<0.01),同時發現甘草瀉心湯對UC 模型無肝腎毒性,證實了其安全性。

TLRs/NF-κB、IL-6/STAT3 信號通路的活化是UC 發生與發展的重要分子生物學機制,近年來的實驗多基于對信號通路的研究探討甘草瀉心湯對UC 的治療機制,證實了甘草瀉心湯可能通過抑制TLR4/NF-κB、IL-6/STAT3 炎癥信號通路中相關核心蛋白和基因的表達,抑制信號通路的活化,下調促炎因子、上調抗炎因子,調節免疫系統從而達到治療UC 的目的。

3 抗氧化應激

氧化應激是機體受到損害時體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態,傾向于氧化,由自由基在體內產生的一種負面作用,氧化應激導致中性粒細胞炎性浸潤,蛋白酶分泌增加,產生大量氧化中間產物,從而導致組織損傷,參與并加重了UC 腸道黏膜的損傷和炎癥的發生[35]。 陳章風[36]以 DSS 將C57 小鼠復制為UC 病理模型,利用血清酶學和分子生物學方法研究甘草瀉心湯治療UC 的可能機制。 研究發現,造模后小鼠血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量明顯降低,結腸組織中一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白含量明顯增高,說明UC 結腸組織中自由基形成,抗氧化應激能力下降。 給藥后(柳氮磺吡啶、甘草瀉心湯)小鼠的血清SOD 含量上升,結腸組織中的iNOS 蛋白表達水平明顯下降。 與柳氮磺吡啶相比,甘草瀉心湯SOD 含量增加幅度大,差異有統計學意義(P<0.05),iNOS 蛋白表達降低水平的差異無統計學意義(P>0.05)。

iNOS 在正常情況下含量很低,UC 病變過程中形成了大量炎性因子如IL-1、TNF-α 可激活腸組織中的iNOS 蛋白,產生一氧化氮(nitricOxide,NO),從而降低機體內SOD 的含量,SOD 是機體重要的抗氧化酶,具有清楚氧自由基、防止組織損傷的能力,SOD 含量的下降進一步加重UC 疾病程度。 將甘草瀉心湯灌胃治療UC 小鼠發現甘草瀉心湯可增加抗氧化能力,發揮協同作用治療UC。

4 調節腸道菌群

人體腸道微生態可分為宿主共生菌、條件致病菌和病原菌,正常情況下,腸道各類菌群與機體互利共生,構成腸黏膜屏障的生物屏障,對外來菌株有定植抵抗作用。 飲食、環境等致病因素作用于機體后,腸道菌群的穩定性遭到破壞,腸道定植抵抗力大為降低,可導致腸道中潛在性病原體(包括條件致病菌)的定植和入侵,引起各種疾病。 余今菁等[37]通過高通量測序技術檢測UC 患者腸道菌群發現UC 患者腸道菌群多樣性、構成及豐度與健康對照人群比較存在顯著差異,UC 患者腸道菌群結構明顯失衡。 邱春雷等[38]在臨床試驗中發現活動期UC 和緩解期UC 患者雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、普拉梭菌及總細菌菌落數均減少,大腸埃希菌、腸球菌菌落數增加;以活動期UC 腸道菌群改變明顯(P<0.05)。 葉佳等[39]研究UC 患者腸道菌群與Th17、Treg 相關性發現,腸道菌群失調可影響Th17/Treg 免疫平衡,調節炎性因子分泌,從而影響UC 發病。 馬曉田、孟娟等[40-41]利用16SrDNA 擴增子測序的方法檢測甘草瀉心湯治療14 日后的小鼠腸道菌群多樣性,發現甘草瀉心湯甘草瀉心湯中劑量組的物種豐度(雙歧桿菌、乳酸桿菌OTUs 序列數目)明顯高于模型組、高劑量組、低劑量組及思連康組,大腸埃希菌、腸球菌的數量明顯低于模型組、思連康組。 在樣本內多樣性分析中,甘草瀉心湯中劑量組Shannon 指數高于高劑量組、低劑量組、思連康組、模型組。 說明甘草瀉心湯可改善提高菌群物種豐度,改善腸道菌群多樣性。

腸道菌群作為腸道黏膜生物屏障在防御腸道疾病上發揮著重要作用,腸道正常菌減少、致病菌增加,菌群多樣性降低會破壞UC 患者免疫系統的平衡,同時加重UC 腸道黏膜的損傷,增加疾病嚴重程度,改善腸道菌群結構、增加腸道菌群豐度是治療UC 的重要治療方案。 動物實驗證實甘草瀉心湯可調節腸道菌群,在臨床上除應用益生菌,也可應用甘草瀉心湯治療UC 患者腸道菌群失衡。

5 總結與展望

UC 是炎癥性腸病最常見的疾病類型之一,自發現以來多見于歐美國家,近年來我國的內鏡檢出病例數有逐漸增加的趨勢。 UC 起病多隱匿,呈發作期和緩解期相互交替的慢性過程,目前臨床上多應用5-氨基水楊酸、糖皮質激素、免疫抑制劑、生物制劑、聯合益生菌等藥物治療和干細胞移植、糞菌移植、心理干預等非藥物治療方法相結合的治療方法,但難以取得滿意療效。 中醫藥作為中華文明的瑰寶,雖未明確提出UC 病名的論述,但早在內經時期就對其病因病機、臨床表現做了相關解說。 東漢時期,醫圣張仲景在《傷寒論》更是提出應用辛開苦降之甘草瀉心湯治療UC 的方法。 到了現代,大量的臨床實驗結果證實了甘草瀉心湯治療UC 的有效性。 為進一步指導臨床治療UC,近年來的實驗在分子生物層面深入探究甘草瀉心湯治療UC 的作用機制,未來需要從UC 其他發病機制考慮,繼續研究甘草瀉心湯治療UC 的機制,也需要對機制研究實驗進行系統評價,以明確其有效性,為臨床治療UC 提供實驗依據。