太赫茲波對小鼠肺癌細胞影響的研究*

董 琦 楊晶瑩 熊子洋 肖移生

江西中醫藥大學中醫學院，江西省南昌市 330004

太赫茲波(Terahertz wave, THz)是20世紀80年代中后期才被正式命名的、頻率范圍在0.1～10THz、波長范圍在0.03～3mm、介于微波與紅外光波之間的一種電磁波。THz具有強穿透、低能性特點,對許多介電材料和非極性物質都有良好的穿透性，且其能量在meV數量級、是普通X射線的幾百分之一。目前，國際上普遍認為THz是一種有很多獨特優點的新輻射源，會給通信、航天、電磁武器、國防、天體研究、無損安檢、生命科學、醫學等領域帶來深遠的影響[1]。

已有研究發現，RNA、DNA、蛋白分子等重要生物分子的空間構象、振動能級和氫鍵能等都處于THz段，故生物體被THz穿透過程時會產生多種獨特的響應[2-4]。THz對腫瘤細胞有怎樣的影響目前尚未見相關報道。本實驗采用體外培養小鼠肺癌細胞(Lewis細胞)，研究其被THz輻射后的增殖、生長情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器 Lewis細胞(我院謝斌教授惠贈，引自ATCC，編號36470TM)；胎牛血清(Gibco公司產品)；高糖DMEM培養基(Gibco公司產品)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Trypan blue(臺盼藍)試劑及Hoechst 33342熒光劑(碧云天公司產品)；752分光光度計為上海醫用分析儀器廠的產品；熒光顯微鏡為OLYMPUS公司產品。

太赫茲波輻射儀(上海康乾醫療科技有限公司)，本儀器是由復旦大學、中國科學院深圳先進技術研究院費倫教授團隊研發的太赫茲波輻射儀，可調控太赫茲波發射強度，擁有專利技術(專利號：ZL032311672)。太赫茲波輻射儀基本參數如下：功率：AV25W，外部可更換保險絲為：Φ5×20mm F 0.5A 250V，重量：2 100g，外形尺寸：280mm×240mm×90mm，工作條件：15～40℃，相對濕度<80%，工作溫度：高檔：(40±3)℃；低檔：(33±3)℃，電源電壓的適用范圍：交流～220V 50Hz或60Hz，定時范圍[(5～60)±2]min，儲存條件：-40～55℃，相對濕度<93%，輻射頭 16只，輻射頭固定托 16只，電源線1根。

1.2 細胞培養及太赫茲波輻射干預 Lewis細胞復蘇后用含10%胎牛血清DMEM(高糖)培養液于37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱內培養。當培養瓶內細胞長滿至85%時，用0.125%的胰酶消化，進行傳代培養，每3d換液傳代1次。

將生長良好的Lewis細胞分成正常對照組、THz低輻射組(相當能量10meV級)、THz中輻射(100meV)組、THz高輻射(300meV)組。各THz輻射組的細胞于傳代培養第2天開始，每天上午9點和下午3點分別接受相應劑量的THz輻射(每次輻射30min，2次/d)，共3d。

1.3 細胞增殖抑制率測定(MTT法) 本實驗每組設10個復孔，實驗重復10次，同時配以空白組(僅加培養液)。到時間點后，96孔培養板的各孔加入MTT液20μl/孔，4h后終止培養，棄去上清，加入DMSO(100μl/孔)，振蕩使結晶物溶解，用自動酶標儀波長570nm處測吸光度值(D570)，計算增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%。

1.4 Trypan blue染色細胞直接計數法 Trypan blue是一種具有陽離子特性的染料，活細胞拒染，死細胞被染成藍色。實驗結束后，以1∶4的比例加入0.4%臺盼蘭使其終濃度為0.1%，染色1min后將長有神經細胞的蓋玻片反蓋在載玻片上，5min之內在光學顯微鏡下計數死細胞及活細胞數。隨機計數200個細胞以上，計算死細胞率(%)=死細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%。實驗重復10次。

1.5 Hoechst33342熒光染色檢測 本實驗每組設10個復孔，實驗重復10次。到時間點后，各孔加入終濃度為10μg/ml的Hoechst33342并于37℃孵育30min，再加入終濃度為1%的多聚甲醛于暗處固定細胞30min。暗處離心棄上清，取細胞涂片并用封片液封片于載玻片上。熒光顯微鏡下觀察結果。在高倍鏡下隨機計數200個細胞并照相。計算凋亡率：凋亡率(%) = 凋亡細胞數/計數的細胞總數×100%。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察 正常對照組的Lewis細胞生長良好，貼壁好，細胞密集，胞體透亮。THz低輻射對細胞生長影響不明顯，狀態良好，培養體系中死細胞極少；隨著THz輻射量加大，中、高劑量組的細胞生長狀態欠佳，數量增加緩慢，部分細胞皺縮，培養體系中懸浮少量死細胞，以THz高劑量組更明顯(圖1)。

圖1 THz對 Lewis細胞的影響(×400)

2.2 MTT檢測結果 THz低輻射組D值與正常對照組接近，說明THz低輻射對Lewis細胞無明顯抑制作用。THz中、高輻射兩組的D值明顯低于正常對照組D值(P<0.01)，表明增大THz輻射量能抑制細胞增殖。見表1。

表1 THz輻射對Lewis細胞生長抑制作用

2.3 Trypan blue染色計數結果 THz輻射實驗結束后，經Trypan blue染色，正常對照組及THz低輻射組的死細胞數量少，兩組間比較無統計學差異(P>0.05)。THz中、高輻射兩組的死細胞增多，且THz高輻射組更明顯；THz中、高輻射組分別與正常對照組比較，均有統計學差異(P<0.01)。見表2。

表2 THz輻射對Lewis細胞生長的影響

2.4 Hoechst33342熒光檢測結果 Hoechst33342是特異性DNA染料，能透過細胞膜與DNA上A-T鍵結合，在紫外線激發下發出藍色熒光，根據細胞核的形態、染色質狀態及熒光強度做判斷。熒光顯微鏡下，活細胞的核呈彌散均勻熒光；凋亡細胞的核或細胞質內可見濃染致密的顆粒、塊狀熒光，如果見到3個或3個以上的DNA熒光碎片被認為是凋亡細胞。 正常對照組及THz低輻射組僅見微量的凋亡細胞，兩組間比較無統計學差異(P>0.05)。THz中、高輻射兩組的細胞凋亡率升高，分別與正常對照組比較，均有統計學差異(P<0.01)，這表明THz輻射也可誘導Lewis細胞凋亡。見表2、圖2。

圖2 THz對 Lewis細胞影響的熒光圖(×400)

3 討論

研究發現生物大分子間的信息應答、精確調控對生物分子集體振動模式引起的分子構象、分子結構及分子環境等變化都非常敏感。許多化合物分子內振動模式的頻率對應于THz范圍，比如氫鍵作用力、范德瓦爾斯力、偶極—偶極作用力、晶格振動和一些分子內集體骨架振動等[1]。但THz對腫瘤細胞的影響尚未見報道，故了解THz對腫瘤細胞的影響具有較強的科學意義。

本實驗采用體外培養Lewis細胞，研究其被THz輻射后的增殖、生長及凋亡等影響。結果發現THz低輻射對Lewis細胞生長、增殖幾乎無影響；THz中、高輻射能明顯抑制Lewis細胞生長、增殖，且高輻射更明顯。此外THz中、高輻射也能誘導Lewis細胞凋亡，故THz中、高輻射誘導Lewis細胞凋亡是其抑制Lewis細胞生長、增殖的機制之一。陳中等[5]采用類似的研究方法，即運用不同劑量的THz輻射K562細胞(人白血病細胞)，亦發現相當于中、高劑量THz能明顯抑制細胞存活；結合本研究結果，可提示THz具有較好的抑制腫瘤細胞存活、抗腫瘤細胞增殖的作用。從THz誘導Lewis細胞凋亡效果來看，以中輻射誘導效果更好，高輻射效果反而下降，筆者推測其原因可能THz高輻射會引起細壞死，這可為THz技術治療腫瘤提供了思路。

因RNA、DNA、蛋白分子等重要生物分子的空間構象、振動能級和氫鍵能等都處于THz段，如核苷酸鏈的振動模式轉變成為結構振動模式，堿基對以集體振動為主[2-4]，故筆者推測THz也影響了腫瘤細胞的分子構象、分子結構、分子間作用力等，從而影響了Lewis細胞的生長、增殖。但THz對生物大分子的空間構象、振動能級和氫鍵能等有何具體影響有待深入研究。另外，有研究報道，太赫茲波輻射對小鼠后，可影響其造血功能，能增加小鼠血液中紅細胞、血紅蛋白的含量，可刺激骨髓細胞粒單系克隆形成[6]。因此，筆者推測Lewis細胞的氫鍵能、分子間作用力等生物結構與正常細胞有不同，這可能是今后抗腫瘤方向新的突破口，其詳細機制有待深入研究。