兒童再生障礙性貧血異基因造血干細胞移植術后免疫重建的臨床研究

游紅亮, 湯苗苗, 李歡歡, 劉玉峰, 王 叨

(鄭州大學第一附屬醫院兒童醫院血液腫瘤科, 河南 鄭州 450052)

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是兒童常見的骨髓衰竭性疾病,多認為其發病機制為自身免疫系統紊亂引起的造血功能減低,異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是治療本病的重要方法。移植后免疫功能的重建是影響預后的重要因素,且與移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)及感染的發生有著密切的關系[1]。目前關于兒童再生障礙性貧血移植后免疫功能重建的報道較少,本研究通過回顧性分析移植后患兒外周血淋巴細胞亞群變化,探討免疫重建規律,并分析其與急性GVHD(aGVHD)的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料:回顧性分析2017年12月至2019年12月在鄭州大學第一附屬醫院兒童醫院血液干細胞移植中心行allo-HSCT 34例AA患兒,其中男性20例,女性14例；中位年齡8歲(1.8～14歲),輸血依賴AA 2例,重型AA 14例,極重型AA 18例,診斷標準參考文獻[2]。供受者HLA配型：5/10相合15例,6/10、7/10相合各1例,9/10相合4例,10/10相合13例,同胞全相合11例,無關全相合2例。移植前排除移植禁忌癥,詳細告知患兒家屬移植風險,并簽署知情同意書。采用簡單隨機抽樣的方法選擇同期我院門診體檢的15例健康兒童為對照組,其中男9例,女6例,中位年齡7歲(1～13歲)。研究方案經醫學倫理委員會批準,征得患兒家屬同意并簽署知情同意書。

1.2移植方式及預處理方案:15例采用骨髓聯合外周血干細胞輸注,19例單用外周血干細胞。預處理采用白舒非(Bu)+氟達拉濱(Flu)+環磷酰胺(CTX)+兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白(ATG)：Bu0.8mg·kg-1·d-1,-7d、-6d；Flu 40mg·m2·d-1、CTX 600mg·m2·d-1及ATG 3mg·kg-1·d-1為 -5d、-4d、-3d、-2d。供者干細胞動員采用粒細胞刺激因子5～10μg·kg-1·d-1,q12h,皮下注射,共5～6d,于動員第5天開始采集供者骨髓液或外周血干細胞。

1.3aGVHD的診斷與預防:aGVHD的診斷標準參考文獻[3],應用環孢素(CsA)+短程甲氨蝶呤(MTX)+霉酚酸酯(MMF)預防aGVHD,具體為：CsA 3mg·kg-1·d-1,-3d開始靜脈滴注,胃腸道恢復后改為口服5～8mg·kg-1·d-1,維持在血藥濃度150ng～250ng/mL,根據病情逐漸調整劑量；短程MTX +1d 15mg/m2,+3d、+6d、+11d 10mg/m2；MMF 25～30mg·kg-1·d-1,-3d開始口服,至移植后30～60d。發生aGVHD時,應用甲潑尼龍、環磷酰胺、抗CD25單抗及間充質干細胞等。

1.4隨訪及淋巴細胞亞群檢測:隨訪至2020年6月,中位隨訪時間549d(3d～1112d),分析移植后患兒淋巴細胞亞群變化及發生aGVHD情況,分為無aGVHD組和有aGVHD組,比較兩組淋巴細胞亞群有無差異。MultiSET四色免洗制備外周血淋巴細胞亞群樣本,采用流式細胞儀式(FACS Calibur流式細胞儀,美國BD公司)檢測移植后第1、3、6、12個月時外周血淋巴細胞亞群比例,15例健康兒童的淋巴細胞亞群作為對照組。

2 結 果

2.1移植后aGVHD發生及生存情況:5例未獲得造血重建,29例造血重建成功。中性粒細胞計數>0.5×109L-1的植入中位時間為12.6d(7d～20d)及血小板>20×109L-1的植入中位時間為11d(4d～23d)。13例患兒發生了aGVHD,其中5例Ⅲ～Ⅳ度,8例為Ⅰ～Ⅱ度。皮膚排異I度5例、Ⅱ度1例、Ⅲ度4例,腸道排異Ⅰ度1例、Ⅱ度1例、Ⅲ度4例、Ⅳ度1例,肝臟排異Ⅰ度3例、Ⅲ度1例。至隨訪結束,存活24例,總生存率為70.59%。死亡10例,其中因aGVHD死亡2例,膿毒血癥4例,心力衰竭、重癥肺炎、腦出血及消化道出血各1例。

2.2與正常對照組相比淋巴細胞亞群變化:CD3+細胞、CD8+細胞比例在移植后移植后第1、3、6、12個月均高于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05),并呈逐漸下降趨勢。CD4+細胞比例、CD4+/CD8+在移植后第1、3、6、12個月均低于于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05),并呈逐漸上升趨勢。B細胞比例在移植后第1、3、6個月均低于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05),并呈逐漸上升趨勢,在移植后第12個月與健康對照組相比無統計學差異(P>0.05)。NK細胞比例在移植后第1個月高于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05),其后與健康對照組相比無統計學差異(P>0.05)(見表1)。

表1 allo-HSCT術后患兒與正常對照組淋巴細胞亞群對比

*P<0.05

2.3無aGVHD組與有aGVHD組相比淋巴細胞亞群變化:無aGVHD組與有aGVHD組相比,CD3+細胞、CD8+細胞比例在移植后第1、3個月較低,NK細胞比例較高,差異有統計學意義(P<0.05)。CD4+細胞比例、CD4+/CD8+、B細胞比例兩組間在移植后第1、3個月無明顯統計學差異(P>0.05)。在移植后6個月時兩組淋巴細胞亞群中除CD4+細胞比例在無aGVHD組與有aGVHD組相比較高外(P<0.05),其他均無明顯差異。在移植后12個月時兩組淋巴細胞亞群相比均無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 無aGVHD組與有aGVHD組的淋巴細胞亞群對比

*P<0.05

3 討 論

預防aGVHD與感染是造血干細胞移植成功的關鍵,而移植后免疫功能的重建與兩者密切相關。HSCT后患兒免疫功能的恢復是動態變化的過程,各淋巴細胞亞群的變化又各有自己的規律,密切觀察移植后免疫重建的過程有重要的臨床意義。

我們研究顯示CD3+細胞比例在移植后第1個月時即恢復且高于正常水平(P<0.05),之后逐漸下降,移植后12個月時仍高于正常水平,CD8+細胞比例呈現同樣的規律。而CD4+細胞比例雖呈逐漸上升趨勢,但恢復較慢,移植后12個月時仍未至正常水平(P<0.05),造成CD4+/CD8+長期倒置,說明早期CD3+細胞中以CD8+細胞為主。Ingham等[4]研究顯示CD8+細胞在移植后3～6個月即可恢復正常水平,而CD4+細胞重建可長達1～2年,與本研究結果相似。移植后T細胞免疫重建主要有外周T淋巴細胞的擴增和供者T祖細胞在胸腺內的發育成熟。有研究表明CD8+細胞增殖可不完全依賴胸腺功能,CD4+細胞卻依賴胸腺[5]。在移植前患兒均接受較強的化療,可造成胸腺功能不同程度的損傷,影響胸腺依賴途徑細胞的增殖,從而造成CD8+細胞、CD4+細胞恢復時間的不同,出現移植后CD4+/CD8+長期倒置。有研究發現角質細胞生長因子具有保護胸腺細胞和促進其修復的作用[6],前體T細胞輸注也可增加胸腺細胞數量和供體的嵌合率[7],但目前臨床應用處于探索階段。

NK細胞比例恢復較快,在移植后第1個月即高于健康對照組(P<0.05),在3個月時降至正常范圍,此后保持穩定,與報道相似[8]。B細胞比例在移植后長期低于健康對照組(P<0.05),至移植后12個月時才達到正常范圍。有文獻報道B細胞在移植后不僅數量增長緩慢,且缺乏成熟B細胞的的功能,對CD4+T細胞依賴的抗體反應長期不能恢復,從而導致移植后患兒體液免疫缺陷,需間斷輸注丙種球蛋白加強支持。

aGVHD是多種免疫細胞和炎癥因子相互作用的結果,是移植后重要的并發癥。本組患兒中13例患兒發生了aGVHD,其中5例Ⅲ～Ⅳ度,8例為Ⅰ～Ⅱ度。無aGVHD組與有aGVHD組相比,CD3+細胞、CD8+細胞比例在移植后第1、3個月時較低,NK細胞比例較高,差異有統計學意義(P<0.05)。CD4+細胞比例、CD4+/CD8+、B細胞比例在移植后第1、3個月無統計學差異(P>0.05)。多數研究顯示CD8+細胞是引起aGVHD重要效應細胞,而CD4+細胞中的Treg細胞可抑制過度的免疫反應,參與預防aGVHD的發生[9]。有文獻發現NK細胞計數與aGVHD的發生呈一定程度的負相關,NK細胞數量較高時,aGVHD發生率越低[10]。有研究報道供者NK細胞在受者體內激活后,可滅活受者體內的抗原遞呈細胞,阻斷aGVHD的起始環節,發揮抗aGVHD作用[11]。由于B細胞恢復較慢,因此在aGVHD中起到作用有限,但有研究顯示B細胞功能缺陷可能與慢性GVHD有關[12]。

綜上所述,再生障礙性貧血患兒接受造血干細胞移植術后CD3+細胞、CD8+細胞及NK細胞重建較快,而CD4+細胞、B細胞恢復緩慢。較高的CD8+細胞及較低NK細胞比例是導致aGVHD重要因素。定期檢測移植后患兒的淋巴細胞亞群變化有助于了解免疫重建情況及預防aGVHD。