九香蟲i型溶菌酶基因的克隆與細菌誘導表達分析

黃海 杜娟 李尚偉 龔濤 齊小浪

摘要

溶菌酶是一組進化上保守的酶，在昆蟲中主要分為c型和i型兩類。為明確i型溶菌酶在九香蟲Coridius chinensis體內的表達模式與功能，我們對九香蟲的兩個i型溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2進行了克隆，這兩個基因的編碼區分別為504 bp和432 bp，分別編碼167和143個氨基酸。序列分析顯示，CcLysi1和CcLysi2缺乏與催化活性相關的谷氨酸（E）和絲氨酸（S）。同源性和聚類分析顯示，CcLysi1和CcLysi2與斯氏珀蝽Plautia stali的i型溶菌酶相似性最高，分別為80.36%和48.95%。采用實時熒光定量PCR（RTqPCR）解析CcLysi1和CcLysi2基因的時空表達譜，結果表明它們在九香蟲不同發育階段都有表達，CcLysi1在成蟲中表達水平最高，而CcLysi2在5齡若蟲中表達水平最高;它們在所檢測的成蟲不同組織中都有表達，都在脂肪體中表達水平最高。九香蟲被注射細菌后24 h，CcLysi1和CcLysi2的表達顯著上調;九香蟲被飼喂細菌后，這兩種基因的表達水平沒有顯著變化。九香蟲的這兩種i型溶菌酶基因的表達受到自身免疫機制的調控，可以被誘導而參與免疫應答，但不具有參與消化的功能。該研究為進一步明確九香蟲i型溶菌酶基因的功能奠定基礎。

??關鍵詞

九香蟲;i型溶菌酶;時空表達;先天免疫;細菌誘導

中圖分類號：Q967

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020669

Cloning and induced expression analysis of the itype lysozyme genes in Coridius chinensis

HUANG Hai，DU Juan，LI Shangwei*，GONG Tao，QI Xiaolang

（Guizhou Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management in Mountainous Regions，

Institute of Entomology， Guizhou University， Guiyang， Guizhou550025， China）

Abstract

Lysozymes are a group of evolutionarily conserved enzymes and can be divided into ctype and itype in insects. In order to clarify the expression pattern and function of the itype lysozyme in Coridius chinensis， we cloned two itype lysozyme genes CcLysi1 and CcLysi2. The coding regions of these two genes were 504 bp and 432 bp， encoding 167 and 143 amino acids， respectively. Sequence analysis showed that CcLysi1 and CcLysi2 lacked glutamic acid （E） and serine （S） related to catalytic activity. Homology and cluster analyses showed that CcLysi1 and CcLysi2

shared the similarity of 80.36% and 48.95%， respectively， with the itype lysozyme from Plautia stali. The spatiotemporal expression profiles of CcLysi1 and CcLysi2 were analyzed by using realtime quantitative PCR （RTqPCR）. The results indicated that these two genes were expressed at various developmental stages of C. chinensis， with the highest expression levels for CcLysi1 in the adults and for CcLysi2 in the fifthinstar nymphs; they were expressed in different tissues of adults and had the highest expression level in the fat bodies. The expression levels of CcLysi1 and CcLysi2 were significantly upregulated within 24 h post bacterial injection， but there were no significant changes in the expression levels of these two genes post bacterial feeding. The expression of these two itype lysozyme genes in C.chinensis was regulated by its own immune mechanism and could be induced to participate in immune response， but they were not involved in digestion. This study laid a foundation for further elucidating the functions of the itype lysozyme genes in C.chinensis.

Key words

Coridius chinensis;itype lysozyme;spatiotemporal expression;innate immunity;bacterial induction

九香蟲Coridius chinensis隸屬于半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae，廣泛分布于我國南方地區，包括云南、四川、貴州、廣西等地，主要以葫蘆科植物的汁液為食，春夏季節常棲息在南瓜等農作物的莖葉上吸食漿液，造成植株生長緩慢，為害嚴重時，可造成植株枯死。 同時，九香蟲也是一種極具開發潛力的昆蟲資源，其蟲體內富含蛋白質、多肽、脂肪酸、維生素以及微量元素等[1- 2]，具有很高的食用和藥用價值[3]。研究表明，九香蟲提取物具有抗菌和抗癌活性[4]，研究發現這些活性主要源于提取物中的一些活性多肽，例如防御素和溶菌酶等[5-8]。此外，九香蟲野生資源數量有限，在自然條件下，九香蟲一年僅發生一代，加之人們對其進行的破壞性采集及環境污染，野生蟲源逐年減少，人工繁殖九香蟲是解決其供不應求的重要途徑[9]。相較于自然環境中的九香蟲，目前完全人工飼養的九香蟲子代常出現畸形、免疫力低下以及細菌感染等嚴重問題，給九香蟲的飼養和繁殖帶來巨大挑戰。因此，提高其子代自身的免疫防御功能和抗病能力也是目前養殖的關鍵，加強對九香蟲免疫系統和免疫防御反應機理的研究勢在必行。

昆蟲在長期的生物進化過程中形成了獨特的免疫系統，僅靠先天免疫就能迅速有效地完成對細菌、病毒或藥物的免疫[10-11]。昆蟲先天免疫主要由體液免疫和細胞免疫組成。體液免疫包括產生抗菌肽、活性氧或氮的中間產物，以及調節血淋巴凝固或黑色素化的復雜酶級聯反應[12 -15]。細胞免疫是指由血細胞介導的免疫反應，包括吞噬、結瘤和包埋[16 -17]。作為體液免疫機制的重要組成部分，抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs）是宿主防御的第一個屏障，能殺死細菌、真菌、病毒和原生動物等微生物或減緩它們的生長[18- 19]。在各種抗菌活性物質中，溶菌酶是最常見的，存在于許多生物中，如細菌、噬菌體、真菌、植物和動物。

溶菌酶在結構、催化和免疫學特性上存在差異。傳統上溶菌酶分為3大類型：雞型溶菌酶（c型）、鵝型溶菌酶（g型）和無脊椎動物型溶菌酶（i型）[20- 21]。溶菌酶通常具有水解酶活性，能水解細菌細胞壁肽聚糖聚合物中N乙酰胞壁酸和N乙酰氨基葡萄糖之間的β1，4糖苷鍵[22- 23]。因此，溶菌酶對于不斷接觸環境中微生物的無脊椎動物尤為重要，可以幫助它們抵御細菌病原體的入侵[24- 26]。i型溶菌酶最初是在海星和海洋雙殼類動物中發現的，在昆蟲中普遍存在[27]。家蠅Musca domestica和海洋雙殼類動物消化器官中溶菌酶的發現還表明了溶菌酶具有參與消化的功能，這類溶菌酶在腸道中高表達[28-30]。此外，據報道i型溶菌酶還具有異肽酶和幾丁質酶活性[31-32]。從醫用水蛭Hirudo medicinalis唾液中分離出的一種i型溶菌酶最初被描述為一種失穩酶（destabilase），因為它能夠溶解交聯纖維蛋白[33]，該酶后來被證明既具有溶菌酶活性又具有異肽酶活性[34]。 作為一組進化上保守的酶，許多在昆蟲中編碼c型和i型溶菌酶的基因在基因組和轉錄組分析中被鑒定出來。目前，研究者已研究了昆蟲c型溶菌酶在蛋白質水平上的功能特征，而對于昆蟲i型溶菌酶只在DNA或mRNA水平上研究了其特征[35]。昆蟲i型溶菌酶可能在進化過程中失去了溶菌酶原有的一些特性，而獲得了新的、尚未確定的功能。

本課題組在前期九香蟲轉錄組測序中共發現了12種抗菌活性多肽， 包括4種昆蟲防御素，1種富含甘氨酸的抗菌肽，1種富含脯氨酸的抗菌肽以及6種溶菌酶。本研究在防御素和c型溶菌酶的研究基礎上選擇2個i型溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2，研究它們與其他物種的i型溶菌酶之間的進化關系，并進行了細菌感染誘導下靶基因表達的分析，初步探索兩種i型溶菌酶在九香蟲生長發育以及先天免疫中的功能。這項研究旨在完善九香蟲溶菌酶在免疫防御機制中的作用，為昆蟲中廣泛存在的i型溶菌酶的研究提供了一定的理論依據與數據支撐。

1材料與方法

1.1昆蟲與供試菌

九香蟲 Coridius chinensis采自貴陽市花溪區，在人工氣候箱中用南瓜葉飼養。飼養溫度（28±1）℃，相對濕度80%，光照周期L∥D=14 h∥10 h。 克隆載體pMD18T和大腸桿菌Escherichia coli感受態細胞TOP10購自生工生物工程（上海）股份有限公司，保存于 80℃冰箱，大腸桿菌 E.coli（ATCC 25922）和藤黃微球菌Micrococcus luteus（CMCC 28001）均保存于貴州大學昆蟲研究所分子生物學實驗室。

1.2RNA提取與基因克隆

采用HP Total RNA Kit（Omega BioTek， GA， USA）提取九香蟲不同發育時期（卵，1～5齡若蟲，雌蟲和雄蟲）以及成蟲各個組織（頭、脂肪體、血淋巴、中腸、肌肉、體壁、精巢和卵巢）的RNA，其中九香蟲血淋巴提取使用雙管離心法[36]。 用NanoDrop 2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific， MA， USA）測定RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific， MA， USA）將提取的RNA反轉錄為cDNA，將合成的cDNA濃度稀釋到300～500 ng/μL，? 20℃保存。根據轉錄組序列信息用Primer Premier 6.0設計PCR引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用2× PCR Master Mix進行PCR，反應條件：95℃預變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s， 35個循環;72℃延伸10 min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用膠回收試劑盒回收產物連接到pMD18T載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞TOP10，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3生物信息學分析

用NCBI的開放閱讀框（Open reading frame， ORF）搜尋數據庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測CcLysi1和CcLysi2（GenBank登錄號見表2）的ORF。在ExPASy ProtParam tool（https：∥web.expasy.org/protparam/）平臺預測兩種溶菌酶的分子量和等電點，并用SignalP 5.0 Server （https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP5.0）分析信號肽及前肽。亞細胞定位使用TargetP 2.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？TargetP2.0）。用NCBI的BLAST進行同源性比較（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），并用MEGAX軟件中的鄰接法構建系統進化樹，重復運行1 000次。用于序列比對和構建進化樹的溶菌酶來源物種和GenBank登錄號見表2。

1.4時空表達譜

采用實時熒光定量PCR（RTqPCR）在CFX96? Touch RealTime PCR儀（BioRad， CA， USA）上檢測CcLysi1和CcLysi2基因在九香蟲不同發育階段和成蟲 不同組織中的表達水平。利用

Primer Premier 6.0 設計溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2 的特異性引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

RTqPCR反應按照2× SYBR Select Master Mix（Thermo Fisher Scientific，? MA， USA）說明書進行，反應體系為20 μL：1 μL cDNA，10 μmol/L上、 下游引物各1 μL，10 μL 2× SYBR Select Master Mix， 7 μL無RNA酶的無菌去離子水。反應程序：50℃ 2 min;95℃預變性2 min; 95℃變性15 s，61℃退火15 s，72℃延伸1 min，40個循環，每個樣本重復3次，以九香蟲βactin基因（GenBank登錄號：MK370101）作內參對照。

1.5細菌注射

大腸桿菌和藤黃微球菌在自然環境中廣泛分布，是動物經常接觸到的細菌，通常在動物出現損傷時會引起傷口感染。溶菌酶等抗菌物質是昆蟲應對細菌感染的第一道屏障，抑制細菌感染是它們最主要的功能。因此，注射細菌通常可誘導這類抗菌物質的產生。將藤黃微球菌和大腸桿菌分別接種于20 mL LB培養基中，于37℃恒溫培養箱，200 r/min振蕩培養至OD600=0.5，10 000 g離心5 min，收集菌體用PBS洗滌，并將兩種細菌混合后懸浮于PBS中調節OD600=0.01（5×106cfu/mL）。隨機選取100頭健康的九香蟲成蟲，每頭腹腔注射1 μL菌液，為排除PBS緩沖液和機械損傷的影響， 用同樣的方法注射無菌的1 μL PBS作為陰性對照。注射后的九香蟲飼養在人工氣候箱中，溫度（28±1）℃，相對濕度80%，光照周期L∥D=14 h∥10 h，分別在無菌條件下收集10頭注射細菌后6、8、12、24、36、48、60 h和72 h時的九香蟲，用液氮速凍。RNA提取和cDNA合成方法同上。采用RTqPCR分析注射細菌后CcLysi1和CcLysi2的表達量，并與九香蟲c型溶菌酶CcLys2進行比較分析（GenBank登錄號：MN816376）。

1.6細菌飼喂

在250 mL LB培養液中接種藤黃微球菌，于37℃搖床，200 r/min振蕩過夜培養至OD600=4，然后10 000 g離心5 min，收集菌體用PBS洗滌，再懸浮于PBS中調節至OD600=2。將采摘的新鮮南瓜莖葉剪碎與藤黃微球菌懸液（OD600=2）混合，放入15 mm×25 mm的透明塑料盒子中。將隨機選取的40頭饑餓12 h的健康九香蟲成蟲轉入該塑料盒子，用尼龍網封口以保證空氣流通并將其放入人工氣候箱中繼續培養，以未混菌的南瓜莖葉飼養的九香蟲為對照。分別收集喂養6、12 h和24 h的九香蟲成蟲中腸，用液氮速凍。總RNA提取、cDNA合成和RTqPCR步驟同上。

1.7數據統計與分析

用2 ΔΔCt法計算不同發育階段、不同組織及細 菌誘導后CcLysi1和CcLysi2的表達水平。RTqPCR表達量相關數據用SPSS 22.0統計軟件進行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯氏新復極差法進行多重檢驗，P<0.05為差異顯著。

2結果與分析

2.1序列驗證與特征分析

CcLysi1和CcLysi2基因經PCR擴增后，電泳顯示在約570 bp和460 bp位置各出現明亮的擴增帶，與預期擴增片段大小一致（圖1），測序結果與來自轉錄組的序列相同。兩種溶菌酶基因在NCBI數據庫中的BLAST結果表明，它們屬于無脊椎動物型（i型）溶菌酶基因。CcLysi1基因的開放閱讀框為504 bp，編碼167個氨基酸，預測分子量為18.04 kDa，理論等電點為5.28（圖2a）。CcLysi2基因的開放閱讀框長度為432 bp，編碼143個氨基酸，預測分子量為15.74 kDa，理論等電點為5.12（圖2b）。亞細胞定位預測顯示，這兩種九香蟲i型溶菌酶均為分泌蛋白，都有一個N端信號肽，信號肽長度分別為21個氨基酸（G21↓Q22，CcLysi1）和24個氨基酸（G24↓L25，CcLysi2）。 結構域分析顯示兩種溶菌酶均具有典型的i型溶菌酶結構域LYZ_i， 且CcLysi1和CcLysi2在糖結合位點上的氨基酸高度一致（圖2）。

2.2序列比對與系統發育分析

將來自九香蟲的4種溶菌酶的成熟蛋白氨基酸序列與其他12個物種的i型溶菌酶氨基酸序列進行比對，這12個物種包括4種軟體動物（美洲牡蠣Crassostrea virginica，菲律賓簾蛤Ruditapes philippinarum和文蛤Meretrix lusoria），2種環節動物（安德愛勝蚓Eisenia andrei和醫用水蛭H.medicinalis），6種節肢動物（果蠅Drosophila serrata，異色瓢蟲Harmonia axyridis，岡比亞按蚊Anopheles gambiae，斑節對蝦Penaeus monodon和克氏原鰲蝦Procambarus clarkii）。多序列比對顯示了i型溶菌酶催化必需的谷氨酸殘基E和天冬氨酸殘基D，以及完全保守的8個半胱氨酸殘基C基序。與c型溶菌酶一樣，谷氨酸殘基E和天冬氨酸殘基D也被認為對i型溶菌酶的催化活性至關重要[37 38]。有趣的是，來自九香蟲的4種溶菌酶以及其他節肢動物的i型溶菌酶至少缺乏這兩種氨基酸殘基中的一個，而環節動物和軟體動物的i型溶菌酶都具有這兩種保守的催化殘基（圖3）。此外，一般認為i型溶菌酶還具有異肽酶活性，并且這種異肽酶活性被認為涉及絲氨酸蛋白酶機制，需要絲氨酸殘基S62和組氨酸殘基H92[39 40]。然而，在節肢動物中絲氨酸殘基S并不保守，除異色瓢蟲外，九香蟲的4種溶菌酶以及其他節肢動物的i型溶菌酶對應位點均沒有發現有絲氨酸殘基S的存在（圖3）。

以九香蟲c型溶菌酶CcLys2和家蠶B.mori的c型溶菌酶BmLZ為外群，用鄰接法構建基于成熟蛋白的系統發育樹，結果顯示來自節肢動物的溶菌酶聚為一支，在另一支中，除了斑節對蝦溶菌酶PmLyzi1外，還包括環節動物、軟體動物以及棘皮動物的i型溶菌酶（圖4）。與其他無脊椎動物i型溶菌酶相比，用于系統發育分析的所有節肢動物i型溶菌酶幾乎都缺失了與胞壁質酶活性相關的特 征催化殘基;在NCBI蛋白數據中對i型溶菌酶的檢索表明，i型溶菌酶中這種推測的催化殘基的缺失在昆蟲中普遍存在。來自九香蟲的4種溶菌酶與斯氏珀蝽Plautia stali和茶翅蝽Halyomorpha halys的溶菌酶聚為一個亞群，這表明它們具有較近的親緣關系;而九香蟲的這4種i型溶菌酶在系統發育樹上的差異，則表明九香蟲i型溶菌酶至少有3種不同的亞型。

2.3時空表達譜

九香蟲溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2的時空表達模式見圖5和圖6，CcLysi1和CcLysi2在九香蟲不同發育時期的表達水平有顯著差異。CcLysi1在成蟲期的表達量最高且雌、雄蟲之間無顯著差異，在5齡若蟲中的表達量次之。CcLysi1在成蟲中的表達量約為在卵中的5倍，5齡若蟲中的3倍（圖5a）。CcLysi2在5齡若蟲中的表達量最高，在4齡若蟲中的表達量次之，在成蟲中的表達量較低。CcLysi2在5齡若蟲中的表達量約為卵中的3倍以及成蟲中的4倍（圖5b）。在檢測的成蟲不同組織中，CcLysi1和CcLysi2具有相似的組織分布模式，兩種i型溶菌酶均在脂肪體有最高的表達量;在其余組織中，CcLysi1主要在血淋巴、精巢和卵巢中表達（圖6a），而CcLysi2在血淋巴和中腸中有較高的表達量（圖6b）。

2.4細菌注射后溶菌酶基因的表達模式

九香蟲被注射細菌后3種溶菌酶基因的表達模式見圖7，與未注射細菌的對照組（CK）相比，雖然CcLysi2 在36 h出現波動，但總體上CcLysi1和CcLysi2以及c型溶菌酶CcLys2的表達水平均顯著上調，表達模式基本一致。CcLysi1和CcLysi2的表達量在24 h內升高并達到最大值，CcLys2則是在60 h內持續保持高豐度并達到最大值;而在注射PBS的樣本中CcLysi1和CcLysi2的表達水平基本保持不變或變化很小（圖7d），說明注射PBS不能誘導這兩種溶菌酶的表達。這些結果表明CcLysi1和CcLysi2與九香蟲的免疫密切相關。

2.5細菌飼喂后溶菌酶基因的表達模式

與注射細菌后的表達模式不同，被飼喂細菌的九香蟲與用南瓜莖葉正常飼喂的九香蟲（CK）相比，僅發現c型溶菌酶CcLys2表達水平在飼喂6 h后有顯著上調，而兩種i型溶菌酶基因的表達豐度在24 h內與對照組相比變化幅度較小，并未上調（圖8），這說明CcLysi1和CcLysi2在中腸中不能被飼喂細菌的方式所誘導，并不參與九香蟲腸道的消化作用。

3結論與討論

溶菌酶作為一種重要的天然免疫因子，廣泛分布于脊椎動物和無脊椎動物[41]。本文報道了來自九香蟲的兩種無脊椎動物型（i型）溶菌酶CcLysi1和CcLysi2，該研究可為其他昆蟲i型溶菌酶同源物的功能注釋提供參考。

先前的研究通過定點誘變方法證實E18和D30在i型溶菌酶TJL催化活性中的重要性，它們被認為是c型溶菌酶HEWL中催化殘基E35和D52的等價物[37-? 38， 42]。然而，在節肢動物中i型溶菌酶缺乏這兩種催化殘基的情況并不罕見，尤其是在昆蟲的i型溶菌酶中。有研究提出昆蟲中c型溶菌酶的功能冗余導致i型溶菌酶失去活性，從而獲得新的功能[43]，在蘋掌舟蛾Phalera flavescens中發現的N乙酰氨基乳糖特異性凝集素被認為是從昆蟲i型溶菌酶進化而來[44]。后續的研究也證明i型溶菌酶具有多種功能，如異肽酶活性、幾丁質酶活性和非酶抗菌活性等[45-46]。在本研究中，序列分析顯示來自九香蟲的2種i型溶菌酶均沒有與胞壁質酶活性相關的谷氨酸殘基E以及異肽酶活性所需的絲氨酸殘基S，僅CcLysi2在對應活性位點上有天冬氨酸殘基D，因此我們推測CcLysi1和CcLysi2可能既沒有胞壁質酶活性也沒有異肽酶活性。在異色瓢蟲中發現的5種i型溶菌酶也存在類似的情況，它們均缺乏與胞壁質酶或異肽酶活性相關的催化殘基，而在后續的研究中被證實沒有相關的酶活性[35]。

無脊椎動物型（i型）溶菌酶在生物體內具有多種功能。在克氏原螯蝦和斑節對蝦中，i型溶菌酶沒有胞壁質酶活性，但仍具有非酶抗菌活性和異肽酶活性[46-47]，其抗菌活性似乎與胞壁質酶之間并沒有必然聯系。在蚊子中，i型溶菌酶被認為在吸血或免疫中起作用[43]。在軟體動物中，i型溶菌酶還被認為具有幫助消化的作用，類似于反芻動物胃中的c型溶菌酶[20， 48-49]。在醫用水蛭中，i型溶菌酶具有異肽酶活性，有分解血凝塊中纖維蛋白的功能[40]。但在目前的研究中，一般認為昆蟲i型溶菌酶缺乏胞壁質酶活性相關的結構域，而其是否具有異肽酶活性尚不清楚[50]，僅研究了它們在DNA或mRNA水平上的特征。為了更好地了解i型溶菌酶在九香蟲中的作用，我們對CcLysi1和CcLysi2的表達水平進行了檢測。CcLysi1和CcLysi2具有相似的組織分布模式，可以在脂肪體、血淋巴以及精巢和卵巢中檢測到。脂肪體和血淋巴在昆蟲的天然免疫系統中非常重要，通常昆蟲抗菌肽在脂肪體中表達后分泌到血淋巴[51-52]。因此，CcLysi1和CcLysi2可能作為抗菌蛋白參與免疫過程，至于檢測到CcLysi1在精巢和卵巢有一定表達水平，則暗示了其可能與九香蟲生長發育有某種聯系。在人類精子頂體中發現的溶菌酶樣蛋白SLLP1就被認為在精卵結合中發揮作用[53]。

有研究表明，異色瓢蟲的一種i型溶菌酶以及岡比亞按蚊的兩種i型溶菌酶并不能被免疫激發所誘導[35]。然而，在我們的研究中，九香蟲的兩種i型溶菌酶不僅可以被誘導，而且與來自九香蟲的c型溶菌酶CcLys2有著相似的表達模式。九香蟲被注射細菌后，CcLysi1和CcLysi2在數小時內持續上調，一般昆蟲在感染細菌后約6～12 h抗菌肽就會出現在被感染昆蟲的血淋巴中[54]，而在注射PBS的樣本中并未檢測到CcLysi1和CcLysi2的表達水平的顯著變化，這表明它們與九香蟲的免疫密切相關。九香蟲喂食混有細菌的南瓜莖葉后兩種基因的表達并未出現上調，則說明CcLysi1和CcLysi2并不在腸腔分泌，雖然有研究表明i 型溶菌酶可能有助消化的作用，但在本研究中沒有證據表明兩種九香蟲i型溶菌酶有這樣的功能，僅c型溶菌酶CcLys2可能存在這種功能。現有的研究表明，i型溶菌酶在不同物種之間具有不同的活性和功能，即使在同一個物種中，不同的i型溶菌酶功能也可能有所不同。在九香蟲的不同發育階段，CcLysi1與CcLysi2表達模式不同，受到九香蟲自身發育的調控。CcLysi1在雌雄成蟲中高表達，且在精巢和卵巢中表達水平較高，這表明該基因可能與九香蟲的生長發育相關，而CcLysi2在若蟲期的表達水平高于成蟲，推測i型溶菌酶可能具有與昆蟲蛻皮相關的幾丁質酶活性。

本研究從九香蟲的轉錄組中篩選并克隆了兩個無脊椎動物型溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2，對這兩種基因的mRNA表達模式進行了解析。研究結果表明，兩種溶菌酶在進化上屬于典型的昆蟲i型溶菌酶，受到九香蟲自身發育的調控，與九香蟲被細菌感染后的免疫應答密切相關。該研究有助于進一步研究i型溶菌酶在九香蟲生長發育和免疫防御中的作用，從而為九香蟲資源的開發提供理論支撐。鑒于i型溶菌酶功能的多樣性及昆蟲i型溶菌酶在蛋白水平功能上的不確定性，下一步我們考慮用RNA干擾或基因編輯（CRISPRCas9）技術對其功能做進一步研究。

參考文獻

[1]李俐， 李曉飛. 貴州九香蟲營養成分分析[J].昆蟲知識， 2010， 47（4）： 748- 751.

[2]劉倫沛， 郁建平. 九香蟲的營養成分分析與評價 [J]. 食品科學， 2008， 29（2）： 406-410.

[3]劉慶芳. 九香蟲現代臨床研究與應用 [J].河南大學學報（醫學科學版）， 2002， 22（4）： 66 -67.

[4]侯曉暉， 孫廷， 李曉飛. 九香蟲粗提物對SGC7901和HepG2細胞增殖及細胞周期的影響 [J]. 時珍國醫國藥， 2013， 24（1）： 108-109.

[5]郭志來. 基于轉錄組測序和真核重組表達的九香蟲（Aspongopus chinensis Dallas）來源防御素和溶菌酶研究 [D]. 貴州： 貴州師范大學， 2018.

[6]李尚偉， 趙柏松， 杜娟. 九香蟲抗菌肽CcAMP1的分離純化和抗菌活性檢測 [J]. 昆蟲學報， 2015， 58（6）： 610-616.

[7]吳瑪莉， 金道超. 九香蟲血淋巴及其純化蛋白抑菌活性的研究 [J]. 昆蟲知識， 2005， 42（3）： 315- 318.

[8]喻廷君， 杜娟， 李尚偉. 九香蟲防衛素基因CcDef1的克隆及特征分析 [J]. 山地農業生物學報， 2019， 38（3）： 6-11.

[9]吳有芳. 九香蟲滯育生理原因初步研究 [D]. 貴州： 貴州大學， 2019.

[10]? CYTRYSKA M， WOJDA I， JAKUBOWICZ T. How insects combat infections [M]∥BALLARIN L， CAMMARATA M. Lessons in immunity. Amsterdam： Academic Press， 2016： 117-128.

[11] HOFFMANN J A. Innate immunity of insects [J]. Current Opinion in Immunology， 1995， 7（1）： 4 -10.

[12] NAKHLEH J， MOUSSAWI L E， OSTA M A. The melanization response in insect immunity [M]∥LIGOXYGAKIS P. Advances in insect physiology. Amsterdam： Academic Press， 2017： 83-109.

[13]? NAPPI A J， CHRISTENSEN B M. Melanogenesis and associated cytotoxic reactions： applications to insect innate immunity [J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology， 2005， 35（5）： 443-459.

[14]? ZUG R， HAMMERSTEIN P. Wolbachia and the insect immune system： what reactive oxygen species can tell us about the mechanisms of Wolbachiahost interactions [J/OL]. Frontiers in Microbiology， 2015， 6： 1201. DOI： 10.3389/fmicb.2015.01201.

[15] YI Huiyu， CHOWDHURY M， HUANG Yadong， et al. Insect antimicrobial peptides and their applications [J]. Applied Microbiology & Biotechnology， 2014， 98（13）： 5807-5822.

[16] LAVINE M D， STRAND M R. LAVINE M D， et al. Insect hemocytes and their role in immunity? [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2002， 32（10）： 1295-1309.

[17] STRAND M R. The insect cellular immune response [J]. Insect Science， 2008， 15（1）： 1-14.

[18] BACHRE E. Antiinfectious immune effectors in marine invertebrates： potential tools for disease control in larviculture [J]. Aquaculture， 2003， 227： 427 -438.

[19] BULET P， STCKLIN R， MENIN L. Antimicrobial peptides： from invertebrates to vertebrates [J]. Immunological Reviews， 2010， 198（1）： 169- 184.

[20] BACHALI S， JAGER M， HASSANIN A， et al. Phylogenetic analysis of invertebrate lysozymes and the evolution of lysozyme function [J]. Journal of Molecular Evolution， 2002， 54（5）： 652-664.

[21]? SIMPSON R J， BEGG G S， DOROW D S， et al. Complete amino acid sequence of the goosetype lysozyme from the egg white of the black swan [J]. Biochemistry， 1980， 19（9）： 1814-1819.

[22] IMOTO T， JOHNSON L N， NORTH A C T， et al. 21 vertebrate lysozymes [J]. The Enzymes， 1972， 7： 665-868.

[23] QASBA P K， KUMAR S， BREW K. Molecular divergence of lysozymes and αlactalbumin [J]. Critical Reviews in Biochemistry， 1997， 32（4）： 255-306.

[24]? HIKIMA S， HIKIMA J I， ROJTINNAKORN J， et al. Characterization and function of kuruma shrimp lysozyme possessing lytic activity against Vibrio species [J]. Gene， 2003， 316（1）： 187-195.

[25] MAI Weijun， HU Chaoqun. Molecular cloning， characterization， expression and antibacterial analysis of a lysozyme homologue from Fenneropenaeus merguiensis [J]. Molecular Biology Reports， 2009， 36（6）： 1587-1595.

[26] MINAGAWA S， HIKIMA J I， HIRONO I， et al. Expression of Japanese flounder ctype lysozyme cDNA in insect cells [J]. Developmental & Comparative Immunology， 2001， 25（5/6）： 439-445.

[27] JOLLS J， JOLLS P. The lysozyme from Asterias rubens [J]. FEBS Journal， 1975， 54（1）： 19-23.

[28] CANADO F C， VALRIO A A， MARANA S R， et al. The crystal structure of a lysozyme c from housefly Musca domestica， the first structure of a digestive lysozyme [J]. Journal of Structural Biology， 2007， 160（1）： 83-92.

[29] MARANA S R， CANADO F C， VALRIO A A， et al. Crystallization， data collection and phasing of two digestive lysozymes from Musca domestica [J]. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications， 2006， 62（Pt 8）： 750-752.

[30] MCHENERY J G， BIRKBECK T H， ALLEN J A. The occurrence of lysozyme in marine bivalves [J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Comparative Biochemistry， 1979， 63（1）： 25-28.

[31]? ITO Y， YOSHIKAWA A， HOTANI T， et al. Amino acid sequences of lysozymes newly purified from invertebrates imply wide distribution of a novel class in the lysozyme family [J]. European Journal of Biochemistry， 1999， 259（1/2）： 456- 461.

[32] JOSKOV R， ILEROV M， PROCHZKOV P， et al. Identification and cloning of an invertebratetype lysozyme from? Eisenia andrei [J]. Developmental & Comparative Immunology，? 2009， 33（8）： 932-938.

[33]? BASKOVA L P， NIKONOV G I. Destabilase， the novel ε（γGlu）Lys isopeptidase with thrombolytic activity [J]. Blood Coagulation and Fibrinolysis， 1991， 2（1）： 167-172.

[34]? ZAVALOVA L L， LAZAREV V N， LEVITSKY S A， et al. Destabilaselysozyme of medicinal leech. Multifunctionality of recombinant protein [J]. Biochemistry， 2010， 75（9）： 1173-1181.

[35] BECKERT A， WIESNER J， SCHMIDTBERG H， et al. Expression and characterization of a recombinant itype lysozyme from the harlequin ladybird beetle Harmonia axyridis [J]. Insect Molecular Biology， 2016， 25（3）： 202-215.

[36] SU T， MULLA M S. Quantitative determination of free amino acids in the hemolymph of autogenous and anautogenous strains of Culex tarsalis （Diptera： Culicidae） [J]. Journal of Medical Entomology， 1997， 34（6）： 729-734.

[37] CALLEWAERT L， MICHIELS C W. Lysozymes in the animal kingdom [J]. Journal of Biosciences， 2010， 35： 127 -160.

[38]? GOTO T， ABE Y， KAKUTA Y， et al. Crystal structure of Tapes japonica lysozyme with substrate analogue： structural basis of the catalytic mechanism and manifestation of its chitinase activity accompanied by quaternary structural change [J]. Journal of Biological Chemistry， 2007， 282（37）： 27459-27467.

[39] FRADKOV A， BEREZHNOY S， BARSOVA E， et al. Enzyme from the medicinal leech （Hirudo medicinalis） that specifically splits endo（γGlu）Lys isopeptide bonds： cDNA cloning and protein primary structure [J]. FEBS Letters， 1996， 390（2）： 145-148.

[40] ZAVALOVA L， LUKYANOV S， BASKOVA I， et al. Genes from the medicinal leech （Hirudo medicinalis） coding for unusual enzymes that specifically cleave endoepsilon （gammaGlu）Lys isopeptide bonds and help to dissolve blood clots [J]. Molecular & General Genetics， 1996， 253（1/2）： 20-25.

[41] PRAGER E M， JOLLèS P J. Animal lysozymes c and g： an overview [J]. EXS， 1996， 75： 9-31.

[42] MALCOLM B A， ROSENBERG S， COREY M J， et al. Sitedirected mutagenesis of the catalytic residues Asp52 and Glu35 of chicken egg white lysozyme [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1989， 86（1）： 133-137.

[43]? PASKEWITZ S M， LI B， KAJLA M K. Cloning and molecular characterization of two invertebratetype lysozymes from Anopheles gambiae [J]. Insect Molecular Biology， 2010， 17（3）： 217-225.

[44] YOKOYAMA K， SATO M， HANEDA T， et al. An Nacetyllactosaminespecific lectin， PFA， isolated from a moth （Phalera flavescens）， structurally resembles an invertebratetype lysozyme [J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology， 2014， 54：106 -111.

[45] BASKOVA I P， ZAVALOVA L L. Polyfunctionality of destabilase， a lysozyme from a medicinal leech [J]. Bioorganicheskaia khimiia， 2008， 34（3）： 337 -343.

[46] ZHANG Hongwei， SUN Chen， SUN Shanshan， et al. Functional analysis of two invertebratetype lysozymes from red swamp crayfish， Procambarus clarkii [J]. Fish & Shellfish Immunology， 2010， 29（6）： 1066- 1072.

[47] SUPUNGUL P， RIMPHANITCHAYAKIT V， AOKI T， et al. Molecular characterization and expression analysis of a ctype and two novel muramidasedeficient itype lysozymes from Penaeus monodon [J]. Fish & Shellfish Immunology， 2010， 28（3）： 490-498.

[48]? DOBSON D E， PRAGER E M， WILSON A C. Stomach lysozomes of ruminants. I. Distribution and catalytic properties [J]. Journal of Biological Chemistry， 1984， 259（18）： 11607-11616.

[49] XUE Q G， ITOH N， SCHEY K L， et al. A new lysozyme from the eastern oyster （Crassostrea virginica） indicates adaptive evolution of itype lysozymes [J]. Cellular & Molecular Life Sciences， 2007， 64（1）： 82-95.

[50]? HERREWEGHE J M， MICHIELS C W. Invertebrate lysozymes： Diversity and distribution， molecular mechanism and in vivo function [J]. Journal of Biosciences， 2012， 37（2）： 327-348.

[51] BOMAN. Geneencoded peptide antibiotics and the concept of innate immunity： an update review [J]. Scandinavian Journal of Immunology， 1998， 48（1）： 15-25.

[52] SEUFI A E M， HAFEZ E E， GALAL F H. Identification， phylogenetic analysis and expression profile of an anionic insect defensin gene， with antibacterial activity， from bacterialchallenged cotton leafworm， Spodoptera littoralis [J/OL]. BMC Molecular Biology， 2011， 12（1）： 47. DOI：10.1186/1471-2199-12-47.

[53] MANDAL A， KLOTZ K L， SHETTY J， et al. SLLP1， a unique， intraacrosomal， nonbacteriolytic， c lysozymelike protein of human spermatozoa [J]. Biology of Reproduction， 2003， 68（5）： 1525-1537.

[54] KANOST M R， JIANG Haobo， YU Xiaoqiang. Innate immune responses of a lepidopteran insect， Manduca sexta [J]. Immunological Reviews， 2004， 198（1）： 97 -105.

收稿日期：2020-12-15修訂日期：2021-02-24

基金項目：

國家自然科學基金（31560610）

* 通信作者

E-mail：swlii@163.com