基于網絡藥理學與分子對接技術探究逍遙丸治療乳腺增生的作用機制

管慶霞，楊芳芳，楊志平，聶澤卉，周小影，林澤榆，陳忠新，鄒淑君

（黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

逍遙丸的前身為逍遙散，其在《太平惠民和劑局方》首次被記載，由柴胡、當歸、白術、芍藥、茯苓、甘草、薄荷、生姜八味藥組成。治血虛勞倦，五心煩熱，肢體疼痛，頭目昏重，心忪頰赤，口燥咽干，發熱盜汗，減食嗜臥，及血熱相搏，月水不調，臍腹脹痛，寒熱如瘧。又療室女血弱陰虛，榮衛不和，痰嗽潮熱，肌體羸瘦，漸成骨蒸，此方常用來疏肝解郁、婦科調經。方中柴胡為君藥，行其疏肝解郁之功。當歸為臣藥，養血和血皆可理氣；白芍亦為臣藥，養血柔肝皆可斂陰；當歸、白芍與柴胡共用，補肝和肝，血和可以達到肝和之效，血液充營則起到柔肝之功，共同作為臣藥起作用。白術、茯苓、甘草共為佐藥，既健脾又益氣，既能實土以御木侮，且使營血生化有源。薄荷少許，疏肝散熱兼行氣；生姜溫中散寒，辛散解郁，兩者為佐藥。柴胡為肝經引經藥，又是方中的使藥。逍遙丸在臨床上可用于治療婦科疾病、免疫疾病、肝臟疾病、應激性損傷、內分泌疾病、神經疾病等，療效確定[1]。現代藥理學研究表明，逍遙丸可以通過使乳腺增生大鼠 ER、PR、ERK含量明顯升高[2]、血清雌二醇（E2）和孕酮（P）水平顯著降低[3]來達到治療乳腺增生疾病的效果。乳腺疾病占所有乳腺疾病的 70%以上，與內分泌紊亂、激素敏感性提高有關，西醫尚沒有療效顯著的方法[4-5]。近年來，隨著中藥對乳腺增生臨床療效的研究不斷深入[6-8]，中醫藥對乳腺疾病的療效越發顯著確切，中醫在乳腺增生疾病治療機制方面具有很大的探究空間。

在探索中藥作用于人體的機制過程中，人們引入了網絡藥理學更加便捷直觀地了解到藥物作用過程，可以為優化用藥過程提供基礎。劉琳[9]等運用網絡藥理學分析了逍遙丸治療抑郁癥的作用機制，楊萍[10]等運用網絡藥理學分析了逍遙丸治療認知障礙的作用機制，陳銘泰[11]等運用網絡藥理學分析了逍遙散治療動脈粥樣硬化和抑郁癥“異病同治”的作用機制。逍遙丸對于乳腺增生的研究日漸深入，但是對于其機制的闡述尚不完全。本課題組利用逍遙丸有效活性成分和乳腺增生潛在靶點，擴充逍遙丸對乳腺疾病治療機制探究，有利于新劑型的研發和藥物新用途的開發。

1 材料與方法

1.1 篩選逍遙丸活性成分并獲取作用靶點

以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）和藥物相似度（Drug likeness，DL）作為篩選條件，在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺[12]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中，以白芍、炒白術、薄荷、柴胡、當歸、茯苓、甘草和生姜為關鍵詞，成分篩選條件為 OB≥30%，DL≥0.18，篩選 8味中藥所含化學活性成分，將納入的化合物成分通過 TCMSP數據庫進行成分的靶點預測。利用Uniprot蛋白質數據庫（Universal Protein，https://www.uniprot.org/）將預測出的蛋白質靶點和基因信息進行規范。

1.2 獲取乳腺增生相關靶點基因

以“hyperplasia of mammary glands”為關鍵詞，在 GeneCards[13]數據庫（https://www.genecards.org/），NCBI基因數據庫[14]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及 OMIM 數據庫[15]（http://ctdbase.org/）中，其中，GeneCards數據庫根據數據庫中score進行中位值的篩選以獲得更相關的靶點，將乳腺增生疾病相關靶點進行匯總，并利用Uniprot蛋白質數據庫將得到的靶點轉化為標準基因名。

1.3 篩選逍遙丸有效成分和乳腺增生疾病的共同靶點

將篩選出的逍遙丸有效成分靶點與乳腺增生疾病靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1（https://www.genecards.org/）中，通過映射構建韋恩圖得到交集基因，可以由所得到的交集基因推斷得到逍遙丸發揮作用的節點，作為藥物作用于疾病的預測靶點進行下面的通路富集分析。

1.4 PPI網絡構建

將藥物疾病共有靶點輸入 String數據庫[16]（https://string-db.org/）進行PPI網絡的構建，將生物種類設定為“Homo sapiens”，可信度＞0.9，獲得PPI網絡數據，并將所得信息導入cytoscape軟件進行相互作用網絡的繪制和進一步分析。

1.4.1 拓撲分析

拓撲分析，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶將PPI網絡導入Cystoscape 3.8.0[17]中，通過NetworkAnalyzer工具進行分析。

1.4.2 MCODE聚類分析

本研究通過MCODE分析進行關鍵基因的篩選。將已經構建好的PPI網絡導入Cytoscape3.6.0中，打開MCODE模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。

1.5 成分-疾病-靶點網絡構建

以納入的成分、治療疾病以及作用靶點為基礎，導入 cytoscape 3.8.0中，構建了成分-疾病-靶點網絡圖，從而更好的理解成分，疾病以及相應靶點之間的復雜相互作用關系。

1.6 關鍵成分篩選

將成分-疾病-靶點網絡圖，導入cytoscape 3.8.0中進行拓撲分析。將成分進行degree的排序，大于平均度值的被篩選為關鍵成分。

1.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將藥物疾病共有靶點進行京都基因（GO）富集分析和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，將物種類設定為“Homo sapiens”，引用String數據庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，獲取數據并繪制氣泡圖和條形圖。GO富集分析使用 R 3.6.3軟件，安裝并引用 clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，進行柱狀圖和氣泡圖繪制。KEGG通路富集分析使用 R 3.6.3，安裝并引用clusterProfiler包后，進行柱狀圖和氣泡圖繪制。

1.8 成分-疾病-通路-靶點網絡構建

將成分-疾病-通路-靶點網絡文件導入Cytoscape 3.8.0進行通路網絡圖的繪制。更直觀地展示中藥活性成分在治療乳腺增生過程中的多成分-多靶點的作用特點。

1.9 分子對接驗證

利用ChemOffice軟件構建關鍵活性成分的3D結構，將格式保存為pdb。在PDB數據庫（http://www.rcsb.org）下載 AKT1（PDB ID：6HHG）、MAPK1（PDB ID：3QYZ）、JUN（PDB ID：2P33）、MAPK3（PDB ID：6GES）、STAT3（PDB ID：5AX3）的晶體結構。運用AutoDock Tools 1.5.6軟件對其進行去水，加氫，分離配體等處理后保存為pdqt格式，藥物關鍵活性成分處理后同亦保存為pdqt格式。使用 AutoDock vina軟件進行分子對接，并用Pymol軟件進行可視化分析對接構象。

2 結果與分析

2.1 逍遙丸活性成分靶點信息查詢

通過 TCMSP數據庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索白芍、炒白術、薄荷、柴胡、當歸、茯苓、甘草和生姜的化合物成分。成分篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18。將納入的化合物成分通過 TCMSP數據庫進行成分的靶點預測。經匯總刪重后，白芍獲得 13個化合物成分，78個靶點；白術獲得7個化合物成分，16個靶點；薄荷獲得 10個化合物成分，97個靶點；柴胡獲得17個化合物成分，176個靶點；當歸獲得2個化合物成分，51個靶點；茯苓獲得 15個化合物成分，23個靶點；甘草獲得93個化合物成分，215個靶點；生姜獲得5個化合物成分，54個靶點。

2.2 疾病靶點查找

在GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/），NCBI基因數據庫[3]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及OMIM數據庫[4]（http://ctdbase.org/）中以“hyperplasia of mammary glands”為關鍵詞進行檢索，經檢索，在GeneCards數據庫檢索到2261條相關基因，NCBI數據庫獲得6個基因，OMIM數據庫獲得455個靶點。將這3個數據庫的基因合并刪重之后，得到2 678個乳腺增生相關基因。

2.3 逍遙丸有效成分和乳腺增生疾病的靶點取交集

將篩選出的藥物靶點與疾病靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，得到169個共有靶點，見圖1。作為藥物作用于疾病的預測靶點進行下面的通路富集分析。

圖1 藥物靶點-疾病靶點韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of targets of herbs and disease

2.4 PPI網絡構建

將藥物疾病共有靶點輸入 String數據庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）進行 PPI網絡的構建，將生物種類設定為“Homo sapiens”，可信度＞0.9，得到 PPI網絡。該網絡中有 169個節點，698條邊，平均度值為 8.26。圖2為 string網站導出的 PPI網絡圖（圖2中的節點越大，顏色越紅，表示度值越大，線越粗表示 edge betweenness越大）。圖3為cytoscape軟件繪制出的PPI網絡圖。

圖2 STRING平臺所做的乳腺增生和逍遙丸共有靶點PPI網絡Fig. 2 PPI network of hyperplasia of mammary glands target and XiaoYaoWan target from STRING

圖3 Cytoscape軟件所做的乳腺增生和逍遙丸共有靶點PPI網絡Fig. 3 PPI network of hyperplasia of mammary glands target and XiaoYaoWan target from Cytoscape

2.4.1 拓撲分析

拓撲分析，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶將PPI網絡導入Cystoscape 3.8.0中，通過NetworkAnalyzer工具進行點，總共篩選出個56關鍵靶點，將前20個靶點使用R 3.6.3進行圖片繪制，其中橫坐標為每個靶點的度值，見圖4。這30個核心蛋白是整個網絡的靶心，是逍遙丸治療乳腺增生的潛在靶點。

圖4 度值排名前20的靶點Fig. 4 Top 20 targets with degree values

2.4.2 MCODE聚類分析

本研究通過MCODE分析[18]進行關鍵基因的篩選。將已經構建好的 PPI網絡導入 Cytoscape 3.6.0中，打開MCODE模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。總共得到7個基因簇和5個核心基因，核心基因為 HTR2A，IL2，TOP2A，PCNA，MMP1。具體信息見表1。

表1 MCODE聚類分析詳細信息表Table 1 MCODE cluster analysis details table

續表1

2.5 成分-疾病靶點網絡構建

為了更好的理解成分，疾病以及相應靶點之間的復雜相互作用關系，作者以納入的成分、治療疾病以及作用靶點為基礎，構建了成分-疾病-靶點網絡圖，導入cytoscape 3.8.0中進行網絡圖的繪制。所構建網絡見圖5。

圖5 逍遙丸“成分-疾病-靶點”網絡Fig. 5 “Ingredient-disease-target” network of XiaoYaoWan

2.6 關鍵成分篩選

在cytoscape 3.8.0中將成分-疾病-靶點網絡圖導入進行拓撲分析，成分按照degree排序，大于平均度值的為關鍵成分，并且degree值越高成分越重要。詳細信息見表2。關鍵成分有槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、葉黃素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、甘草酮 a（licochalcone a）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、芒柄花素（formononetin）、醋栗素（acacetin）等，可能是逍遙丸治療乳腺增生發揮作用的主要活性成分。

表2 關鍵成分信息表Table 2 Table of key ingredient information

續表2

2.7 GO富集分析

將藥物疾病共有靶點進行 GO的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cell component，CC）富集，引用String數據庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，總共富集到2 328條生物過程，160項分子功能相關，47項細胞組成相關，結果見圖6～7。分析發現逍遙丸治療乳腺增生的生物過程中位于前列的有氧化應激反應、細胞對化學應激的反應、對類固醇激素的響應、對脂多糖的響應、對細菌起源分子的響應、活性氧代謝過程、細胞對氧化應激的反應等過程；細胞組成位于前列的是膜筏、膜微域、囊泡、平滑肌細胞的小凹等；其分子功能中位于前列的是結合跟 DNA相關的轉錄因子、結合跟RNA聚合酶2-特定的DNA相關的轉錄因子、結合細胞因子受體、細胞因子活性、核受體活性等。

圖6 富集分析柱狀圖Fig. 6 Enrichment analysis histogram

圖7 GO富集分析氣泡圖Fig. 7 GO Enrichment analysis bubble diagram

2.8 KEGG通路富集

將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數據庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，總共富集到166條信號通路，分析結果見圖8、圖9。主要包括糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、TH17細胞分化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化等信號通路，揭示了逍遙丸通過不同靶點作用于不同的通路來治療乳腺增生。乙肝、丙肝、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、前列腺癌、麻疹、人巨細胞病毒感染提示逍遙丸可能對其他疾病的治療也有效，這也體現了異病同治的原則。

圖8 KEGG通路富集分析柱狀圖Fig. 8 KEGG pathway Enrichment analysis histogram

圖9 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig. 9 KEGG pathway Enrichment analysis bubble diagram

2.9 成分-疾病-通路-靶點網絡構建

將成分-疾病-通路-靶點網絡文件導入Cytoscape 3.8.0得到如圖10所示網絡圖，表明逍遙丸可能通過多成分、多靶點、多通路抑制乳腺增生的發生、發展。

圖10 逍遙丸“成分-疾病-通路-靶點”網絡Fig. 10 “Ingredient-disease-pathway-target” network of XiaoYaoWan

2.10 分子對接

關鍵活性成分與核心靶點進行分子對接驗證結果現實分子對接結合能均為負值，說明受體與配體可自發結合。親和能越高，結合越差；反之，親合能越低，結合越好。根據小分子與靶點對接的親和能結果，可發現核心活性成分與關鍵靶點均有較好的結合能，說明中藥在發揮臨床療效中多成分多靶點的特質。

表3 關鍵靶點對接結果Table 3 Molecular docking result of the key targets

圖11 逍遙丸中核心成分的分子對接模式圖Fig. 11 Molecular docking mode diagram of core components in Xiaoyao Pills

3 討論

乳腺增生在中醫學中屬于“乳癖”范疇，具體表現有乳房疼痛、有腫塊、液體溢出，情志和月經周期也會有波動，在臨床乳房疾病中發生率最高，并且乳腺增生嚴重很有可能發展為乳腺癌[19]。目前西醫治療乳腺增生主要有三苯氧胺、他莫昔芬、托瑞米芬[20]，中醫治療乳腺增生主要有逍遙散、柴胡疏肝散、乳癖散等。蘇炯強[21]等以負性情緒評分、乳房疼痛評分、乳房腫塊大小為指標研究發現逍遙散組治療乳腺增生療效高于常規西藥組，揭示逍遙散治療乳腺增生療效確切，但是關于逍遙散治療乳腺增生機制尚不明確。本課題組以網絡藥理學為基礎，構建了“成分-疾病-通路-靶點”網絡，直觀科學地分析了逍遙丸對乳腺增生的作用機制。

選取所得到的關鍵靶點的前5個分別是STAT3、AKT1、MAPK1、JUN、MAPK3。在人類基因自我更新過程中，STAT3發揮著重要的作用，陳英杰等[22]研究發現 STAT3在乳腺增生和三陰性乳腺癌組織中顯著表達，并且其表達具有顯著差異。AKT1可以促進正常乳腺細胞的生長，抑制其凋亡，進而對乳腺增生產生治療作用[23]。MAPK信號通路通過調節下游產物活性，影響炎癥細胞黏附血管內皮、在炎癥部位激活并釋放炎癥因子以及凋亡過程[24]，從而在乳腺增生治療過程中發揮作用。其中 MAPK1能參與到早期乳腺組織的增殖分化過程中，在卵巢和乳腺上皮細胞中的研究表明抑制 MAPK1進入細胞核會導致上皮細胞生長受到抑制，下調的 MAPK1也容易促進細胞凋亡[25-26]。上述這些靶點的明確為治療乳腺增生藥物新劑型和體內藥動學研究提供了依據。

HTR2A、IL2、TOP2A、PCNA、MMP1為該藥治療乳腺增生的核心基因。王齊敏[27]通過沉默MMP-1基因，發現其可以抑制乳腺癌細胞的侵襲、增殖，進而對三陰性乳腺癌治療作用。PCNA表達僅限于細胞核內，是一種細胞增殖蛋白，可以反應細胞增殖的活性[28]。很大一部分乳腺癌患者群體會擴增或過量表達出 TOP2A型基因[29]。IL2在免疫調節中起著重要作用，其是輔助性 T淋巴細胞分泌的細胞因子。Chulpanova[30]等通過研究發現細胞松弛素B誘導過表達IL2的的人間充質干細胞膜泡能夠刺激CD8 T細胞殺傷三陰性乳腺癌細胞，說明其在乳腺中有一定的表達并且能夠發揮抗癌作用。Hejazi[31]等以HTR2A等為指標得出5-羥色胺受體拮抗劑可能成為治療乳腺癌細胞的新途徑，說明 HTR2A在乳腺組織中有表達。由文獻及網絡藥理學結果可知，乳腺增生和乳腺癌有很密切的聯系，這也為乳腺癌預防及檢查提供了一定依據。

槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、葉黃素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、甘草酮a（licochalcone a）為治療乳腺增生的關鍵成分。槲皮素是一種天然的黃酮醇類化合物，具有顯著的抗氧化作用，其可提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，增強模式生物和非模式生物的氧化應激能力[32]。山奈酚也是黃酮醇類化合物，且與槲皮素結構相似，亦有抗氧化作用，具有消除自由基功能[33]。葉黃素是一種類胡蘿卜素，蘭芳[34]等研究發現葉黃素組小鼠組織內超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，進而發揮抗氧化作用；可通過減少對免疫細胞細胞膜等的損害，提高免疫力；可誘導細胞凋亡[35]，根據相關報道，對細胞增殖和凋亡的調節是中藥參與乳腺增生治療過程中的主要環節[36]。柚皮苷是一種天然雙氫黃酮類化合物，Song等[37]通過動物實驗推斷出柚皮苷能通過調節VEGF/VEGFR-2通路來激發血管再生，而乳腺增生需要的營養大多從血管獲得，這與治療乳腺增生機制相違背，但是其亦有抗氧化、抗炎的藥理作用[38]，其在這過程中如何發揮作用是未來需要深入探討的。甘草查爾酮A屬于酚類查爾酮化合物，其具有抗氧化、抗炎、免疫促進等藥理作用[39]，但是其對于乳腺組織及細胞的研究甚少，提示甘草查爾酮A對于乳腺增生的潛在治療機制是未來需要分析的新方向。

通過通路富集分析，逍遙丸可以通過干預糖尿病并發癥的 AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、TH17細胞分化等信號通路發揮治療乳腺增生的作用。AGEs-RAGE軸調控的多條信號傳導通路[40]，包括氧化應激、蛋白激酶C的活化、己糖胺途徑、多元醇途徑、脂質代謝紊亂和炎癥反應，其中氧化應激、脂質代謝、多元醇途徑涉及逍遙丸治療乳腺增生的生物過程。研究結果顯示，逍遙丸中的活性成分可能通過 MAPK1、IL6、AKT1、MAPK3、STAT3等關鍵蛋白在AGE-RAGE信號通路發揮作用，從而治療乳腺增生。AGE-RAGE信號通路目前在治療糖尿病的過程中研究較多，對于乳腺增生過程中其作用機制研究甚少，有廣闊的探究空間。TNF為腫瘤壞死因子，對腫瘤細胞具有選擇性殺傷作用，參與全身的炎癥反應，可通過調節 IL-6水平、TNF-α水平達到調節免疫的效果，進而參與乳腺增生的治療[41]。研究顯示逍遙丸活性成分可能通過作用于 MAPK1、JUN、MAPK3、MMP3、AKT1、IL-6等關鍵靶點及基因，靶向TNF信號通路調控相關炎癥因子的表達，發揮治療作用。IL-17A可以激活 NF-κB、MAPKs和 C/EBP級聯信號，使一系列炎癥因子的表達上調[42]，產生炎癥反應。網絡藥理學結果發現其活性成分可能作用于MMP1、MMP3、MAPK1、MAPK3、PTGS2 等關鍵靶點，進而阻斷 IL-17信號通路，發揮抗炎作用。TH7細胞主要效應因子是IL-17，研究結果顯示逍遙丸活性成分可能通過作用于 STAT1、STAT3、MAPK1等關鍵蛋白對TH17細胞分化信號通路產生影響，發揮治療作用，其發揮作用過程可能與 IL-17信號通路相同。通過上述分析可知，逍遙丸治療乳腺增生過程中主要作用機制是抗炎，還有一部分免疫調節和減輕氧化應激反應作用。但是對于性激素的調節并沒有表現出來，這提示我們雖然中藥有多成分、多靶點的特點，但是逍遙丸治療乳腺增生過程中可能抗炎作用占比較大。

綜上所述，逍遙丸中的槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、葉黃素（luteolin）可能通過 STAT3、AKT1、MAPK1、HTR2A、IL2、MMP1等核心靶點和核心基因，對TNF信號通路、IL-17信號通路、TH17細胞分化等信號通路進行調節，來增強氧化應激能力、提高免疫力、抗炎、調控細胞凋亡等，發揮對乳腺增生的治療作用。本研究表明逍遙丸可能通過多成分、多靶點、多通路抑制乳腺增生的發生、發展，為本課題組研究逍遙丸治療婦科疾病提供依據和理論基礎。